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Patologia de neonatos bovinos originados por meio da técnica de transferência nuclear de células somáticas – clonagem; Pathology of bovine neonates generated by somatic cell nuclear transfer – Cloning

SANTOS, Caio Rodrigues dos; GRANDI, Fabrizio; MIGLINO, Maria Angélica; MEIRELLES, Flávio Vieira; MAIORKA, Paulo Cesar
Fonte: São Paulo Publicador: São Paulo
Tipo: Artigo de Revista Científica
POR
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66.01%
Os mecanismos de morte em animais clonados a partir de células somáticas são poucos elucidados. Malformações de órgãos, alterações de tamanho e peso desses animais foram anomalias já descritas, porém em casos isolados. Desse modo, estudos nos níveis anatomo e histopatológicos são de suma importância para ajudar a compreensão dos fatores responsáveis pelos altos índices de insucessos com a utilização da TNCS (transferência nuclear de células somáticas). Assim, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de descrever, por meio de exames anatomopatológicos, as alterações presentes em um grupo de animais gerados por TNCS, que vieram a óbito entre 1 e 19 dias de vida. Esse experimento foi realizado entre os anos de 2004 e 2008 na fazenda Tambaú, cidade de Tambaú, Estado de São Paulo. No total foram gerados 21 animais da raça Nelore (Bos indicus), sendo que 11 vieram a óbito e dez apresentaram boa evolução clínica no período perinatal. Foram realizadas as necropsias dos animais e posterior análise histopatológica de tecidos alterados. Esse estudo mostrou alta prevalência de alterações cardiopulmonares, que provavelmente foram determinantes nos mecanismos de morte dos animais. Dentre essas alterações a hipertensão pulmonar e modificações hemodinâmicas diagnosticadas através do exame histopatológico foram as mais frequentes; The death mechanisms in cloned animals are not well elucidated. There are few cases describing organ malformation...

Produção de animais transgênicos por transferência nuclear como modelo de estudo biológico; Production of transgenic animals by nuclear transfer: model for biological studies

BRESSAN, Fabiana Fernandes; MIRANDA, Moyses dos Santos; DE BEM, Tiago Henrique Camara; PEREIRA, Flávia Thomaz Verechia; BINELLI, Mario; MEIRELLES, Flávio Vieira
Fonte: Belo Horizonte Publicador: Belo Horizonte
Tipo: Artigo de Revista Científica
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66.07%
O recente progresso na clonagem animal por transferência nuclear (TN) possibilitou a produção de animais transgênicos utilizando linhagens de células doadoras de núcleo modificadas geneticamente. A possibilidade de manipulação genética, o estudo da expressão gênica e a adequada seleção da célula doadora de núcleo não somente podem garantir a presença da construção gênica em toda a prole, como também podem evitar a produção de animais portadores de modificações indesejáveis resultantes da inserção aleatória do inserto em regiões codificantes do genoma. Esta revisão tem como objetivo discutir a utilização da transferência nuclear de célula somática (TNCS) como método de escolha para a transgenia animal.; Recent progress in animal cloning by nuclear transfer (NT) has made possible the production of transgenic animals using previously genetically modified cell lineages. The possibility of genetic manipulation, gene expression studies and adequate selection of the nuclei donor cell for NT not only can guarantee the presence of the gene construction in the offspring, but also can avoid the production of animals that carries undesirable characteristics, often as a result of the random insertion of transgenes in transcripted areas of the genome. This review aims to discuss the use of somatic cell nuclear transfer (SCNT) in animal transgesis.

Efeito do número da passagem e do gênero das células doadoras de núcleo no desenvolvimento de bovinos produzidos por transferência nuclear; Effect of culture time and gender of nuclei donor cells on bovine development produced by nuclear transfer

MERIGHE, Giovana Krempel Fonseca; MIRANDA, Moysés dos Santos; BEM, Tiago Henrique Câmara de; WATANABE, Yeda Fumie; MEIRELLES, Flávio Vieira
Fonte: Sociedade Brasileira de Zootecnia Publicador: Sociedade Brasileira de Zootecnia
Tipo: Artigo de Revista Científica
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66.01%
Objetivou-se com este trabalho avaliar o efeito do número da passagem e do sexo das células doadoras de núcleo no desenvolvimento embrionário e fetal após transferência nuclear. Para isso, oócitos bovinos foram maturados, enucleados e reconstruídos com células somáticas de animal adulto. Após a fusão e ativação química, os zigotos reconstituídos foram cultivados em Charles Rosenkranz 2 (CR2) com monocamada de células da granulosa a 38,8ºC em atmosfera umidificada a 5% de CO2 em ar, durante sete dias, e transferidos para receptoras sincronizadas. As taxas de clivagem e desenvolvimento a blastocisto de embriões reconstruídos com células cultivadas por tempo maior foram inferiores às obtidas com os demais tempos de cultivo. Além disso, os blastocistos produzidos não resultaram no desenvolvimento de uma gestação a termo. Embora a taxa de clivagem em embriões fêmeas tenha sido maior, o número de embriões que atingiram o estádio de blastocisto foi maior nos embriões machos. No período gestacional, fêmeas apresentaram maior taxa de aborto entre 90 e 120 dias de gestação. Esses resultados indicam que células doadoras de núcleos cultivados por longos períodos dificultam a produção de blastocistos e aumentam as chances de perdas durante a gestação. Embriões clonados machos têm maior competência para se desenvolver a blastocisto e resultam em menor taxa de perda gestacional.; The objective of this study was to evaluate the effects of culture time and sex of nuclei donor cells on embryo and fetal development after nuclear transfer. Thus...

Passagem celular, sexo e transcrição X-específica interferem no desenvolvimento embrionário e fetal de bovinos produzidos por transferência nuclear; Celular passage, sex and X-specific transcription interfere in bovine nuclear transfer embryo and fetal development

Merighe, Giovana Krempel Fonseca
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Tese de Doutorado Formato: application/pdf
Publicado em 24/10/2007 PT
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Células cultivadas por longos períodos acumulam alterações genéticas e epigenéticas que resultam frequentemente em uma inapropriada reprogramação nuclear de embriões submetidos à transferência nuclear a partir de células somáticas (TNCS). Além disso, a variável sexo é um fator limitante na produção de blastocistos e na competência de desenvolvimento pós-implantação de embriões produzidos in vitro. Desta maneira, o objetivo deste trabalho foi estudar o efeito do número da passagem nos experimentos de transferência nuclear, bem como, avaliar o efeito do sexo no desenvolvimento in vitro e no potencial pós-implantação destes embriões. Para tanto, oócitos derivados de matadouro foram enucleados e reconstruídos com células somáticas de animal adulto a partir de 18 horas pós-maturação. Após a fusão (dois pulsos de 2,25 kv/cm durante 65 µseg) e ativação química (ionomicina - 5,0 µM durante 5 minutos e 6-DMAP - 2,0 mM durante 3 horas), os zigotos reconstituídos com núcleo de célula somática foram cultivados em CR2 com monocamada de células da granulosa a 38,8ºC, em atmosfera umidificada e 5% de CO2 em ar durante 7 dias. Os resultados foram analisados utilizando o teste Qui-quadrado (X2). No cultivo in vitro...

Produção de animais transgênicos por transferência nuclear como modelo de estudo biológico; Production of transgenic bovine by nuclear transfer: model for biological studies

Bressan, Fabiana Fernandes
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Dissertação de Mestrado Formato: application/pdf
Publicado em 27/06/2008 PT
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66.11%
A produção de animais transgênicos possui aplicações que envolvem desde a pesquisa básica à produção agropecuária. O recente progresso na clonagem animal por transferência nuclear (TN) possibilitou a produção de animais transgênicos utilizando linhagens de células doadoras de núcleo previamente modificadas geneticamente. A possibilidade de manipulação genética, estudo da expressão gênica e adequada seleção da célula doadora de núcleo na TN não somente pode garantir a presença da construção gênica em toda a prole, como também pode evitar a produção de animais portadores de modificações indesejáveis resultantes da inserção do inserto em regiões codificantes do genoma, em decorrência da inserção aleatória das técnicas de transferência gênica mais comuns. Este trabalho teve como objetivo geral produzir animais transgênicos a partir de transferência nuclear utilizando como células doadoras de núcleo fibroblastos modificados geneticamente por transdução lentiviral. Objetivos específicos foram a produção e caracterização de linhagens de fibroblasto fetal portadores do gene da Proteína Fluorescente Verde (eGFP) quanto à seleção da expressão do transgene, passagem celular e posição da inserção do transgene e sua utilização na técnica de transferência de núcleos para a análise da competência de desenvolvimento a blastocisto e estabelecimento de gestações. Para tal...

Contribuição ao estudo da hematologia de bezerros da raça nelore, originados por meio da técnica de transferência nuclear de célula somática (TNCS) - Clonagem; Contribution to the study of hematology of Nelore calves produced by somatic cell nuclear transfer

Komninou, Eliza Rossi
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Dissertação de Mestrado Formato: application/pdf
Publicado em 22/08/2008 PT
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66%
A presente pesquisa teve a finalidade de estudar a hematologia de bezerros clonados da raça Nelore, originados por meio da técnica de transferência nuclear de células somáticas (TNCS) por meio da avaliação do quadro eritrocitário, da dinâmica dos tipos de hemoglobina e do metabolismo do ferro destes animais durante o primeiro mês de vida. O delineamento experimental envolveu a colheita de 260 amostras de sangue e soro sanguíneo de 20 bezerros distribuídas nos seguintes momentos: imediatamente após o nascimento, 12 horas após o nascimento, 1 dia de vida, 2 , 3 , 4, 5, 7, 10, 15, 20 e 30 dias de vida. Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais: 12 bezerros obtidos por meio da técnica de TNCS pelos laboratórios A e 8, 4 por meio de fertilização in vitro (FIV) e 4 por monta natural (MN). A ocorrência de anemia de grau moderado a grave, do tipo normocítico e normocrômico, foi observada em 100 % (5/5) dos 5 bezerros clonados pelo Laboratório A, enquanto a incidência nos bezerros clonados pelo Laboratório B foi igual a 14,2 % (1/7), nos bezerros obtidos por fertilização in vitro foi igual 50,0 % (2/4) e em bezerros obtidos por monta natural foi igual a 50,0 % (2/4). A avaliação do eritrograma dos bezerros cio nados pelo Laboratório A evidenciou que a anemia instalou-se gradualmente a partir das 12 horas de vida atingindo ao final da primeira semana...

Uso de oócitos bovinos como citoplasma receptor na produção de embriões por transferência nuclear de célula somática interespécie (NTSCi); Use of bovine oocytes as recipient cytoplasm in the production of embryos through nuclear transfer of interspecies somatic cells (NTSCi)

Forell, Fabiana; Feltrin, Cristiano; Santos, Lucila Carboneiro dos; Costa, Ubirajara Maciel da; Vieira, Arnaldo Diniz; Hölker, Michael; Rodrigues, Jose Luiz
Fonte: Universidade Federal do Rio Grande do Sul Publicador: Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Tipo: Artigo de Revista Científica Formato: application/pdf
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66%
Embriões clones interespécie vêm sendo produzidos por diferentes grupos de pesquisa, com relativo sucesso em algumas espécies. Oócitos bovinos maturados in vitro e enucleados por micromanipulação foram utilizados em três experimentos como citoplasma receptor na transferência nuclear de fibroblastos ovinos, caprinos e suínos. Os fibroblastos foram cultivados até a terceira passagem antes de serem congelados e utilizados. A eletrofusão foi induzida pela aplicação de um pulso de 20 V durante 45 ms. A ativação foi realizada com 5 mM de ionomicina e 2 mM de 6DMAP. Embriões NTSC bovinos, NTSCi caprinos e ovinos foram cultivados em meio SOF, e embriões NTSCi suínos foram cultivados em NCSU23. As taxas de fusão dos complexos reconstruídos com células bovinas não diferiram daquelas observadas com células ovinas (88,2%), caprinas (74,1%) e suínas (79,4%). As taxas de clivagem nos grupos NTSCi ovino (60,3%), caprino (68,4%) e suína (57,1%) não diferiram dos grupos controles NTSC bovino. A taxa de blastocisto observada nos embriões NTSCi ovinos (10,3%) foi semelhante à taxa observada no grupo NTSC bovino (12,7%). No grupo NTSCi caprino, 5,3% dos embriões chegaram ao estádio de blastocisto, enquanto que no grupo NTSCi suíno não houve desenvolvimento até o estádio de blastocisto. O citoplasma bovino foi capaz de suportar o desenvolvimento de embriões NTSCi até o estádio de blastocisto utilizando-se núcleo de fibroblatos ovinos e caprinos.; Interspecies embryo clones have been produced by research groups with relative success in some species. Bovine oocytes matured in vitro and enucleated by micromanipulation were used in three experiments as recipeient cytoplasm in nuclear transfer of ovine...

Otimização do sistema de produção de clones por transferência nuclear de célula somática (NTSC); Cloning by Somatic Cell Nuclear Transfer - Procedures optimization

Forell, Fabiana; Feltrin, Cristiano; Santos, Lucila Carboneiro dos; Costa, Ubirajara Maciel da; Vieira, Arnaldo Diniz; Hölker, Michael; Rodríguez, José Luis
Fonte: Universidade Federal do Rio Grande do Sul Publicador: Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Tipo: Artigo de Revista Científica Formato: application/pdf
POR
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66.1%
A técnica de transferência nuclear é uma ferramenta que possibilita a produção de embriões clones que podem ser utilizados tanto na clonagem reprodutiva como no modelo para o estudo de diversos mecanismos fisiológicos durante o desenvolvimento embrionário. Neste sentido, embriões clones bovinos foram produzidos por transferência nuclear, com o objetivo de estabelecer a técnica de clonagem, bem como otimizála para as condições do Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução da UFRGS. Durante este estudo, 1.123 estruturas foram reconstruídas em diferentes condições, sendo que 95 blastocistos foram produzidos em 56 replicações. O primeiro blastocisto foi produzido na 5ª rotina. Após a transferência de parte destes embriões, 13 prenhezes foram estabelecidas, entretanto, a maioria delas foi interrompida no terço inicial da gestação. Uma prenhez gemelar alcançou 260 dias, momento em que os fetos foram abortados. Outra gestação foi a termo, com o nascimento de um clone vivo, porém, o animal veio a óbito 42 horas após o nascimento.; The nuclear transfer technique is a tool that makes possible the production of embryos clones that can be used to provide the birth of identical animals or as model for the study of several physiologic mechanisms...

The ability of mouse nuclear transfer embryonic stem cells to differentiate into primordial germ cells

Mansouri,Vahid; Salehi,Mohammad; Nourozian,Mohsen; Fadaei,Fatemeh; Farahani,Reza Mastery; Piryaei,Abbas; Delbari,Ali
Fonte: Sociedade Brasileira de Genética Publicador: Sociedade Brasileira de Genética
Tipo: Artigo de Revista Científica Formato: text/html
Publicado em 01/01/2015 EN
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65.94%
Nuclear transfer embryonic stem cells (ntESCs) show stem cell characteristics such as pluripotency but cause no immunological disorders. Although ntESCs are able to differentiate into somatic cells, the ability of ntESCs to differentiate into primordial germ cells (PGCs) has not been examined. In this work, we examined the capacity of mouse ntESCs to differentiate into PGCs in vitro. ntESCs aggregated to form embryoid bodies (EB) in EB culture medium supplemented with bone morphogenetic protein 4(BMP4) as the differentiation factor. The expression level of specific PGC genes was compared at days 4 and 8 using real time PCR. Flow cytometry and immunocytochemical staining were used to detect Mvh as a specific PGC marker. ntESCs expressed particular genes related to different stages of PGC development. Flow cytometry and immunocytochemical staining confirmed the presence of Mvh protein in a small number of cells. There were significant differences between cells that differentiated into PGCs in the group treated with Bmp4 compared to non-treated cells. These findings indicate that ntESCs can differentiate into putative PGCs. Improvement of ntESC differentiation into PGCs may be a reliable means of producing mature germ cells.

Embryonic Development following Somatic Cell Nuclear Transfer Impeded by Persisting Histone Methylation

Matoba, Shogo; Liu, Yuting; Lu, Falong; Iwabuchi, Kumiko A; Inoue, Azusa; Zhang, Yi
Fonte: Elsevier BV Publicador: Elsevier BV
Tipo: Artigo de Revista Científica
EN_US
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65.94%
Mammalian oocytes can reprogram somatic cells into a totipotent state enabling animal cloning through somatic cell nuclear transfer (SCNT). However, the majority of SCNT embryos fail to develop to term due to undefined reprogramming defects. Here we identify histone H3 lysine 9 trimethylation (H3K9me3) of donor cell genome as a major epigenetic barrier for efficient reprogramming by SCNT. Comparative transcriptome analysis identified reprogramming resistant regions (RRRs) that are expressed normally at 2-cell mouse embryos generated by IVF but not SCNT. RRRs are enriched for H3K9me3 in donor somatic cells, and its removal by ectopic expression of the H3K9me3 demethylase Kdm4d not only reactivates the majority of RRRs, but also greatly improves SCNT efficiency. Furthermore, use of donor somatic nuclei depleted of H3K9 methyltransferases markedly improves SCNT efficiency. Our study thus identifies H3K9me3 as a critical epigenetic barrier in SCNT-mediated reprogramming and provides a promising approach for improving mammalian cloning efficiency.

Nuclear transfer of porcine embryos using cryopreserved delipated blastomeres as donor nuclei

Nagashima, H.; Ashman, R.; Nottle, M.
Fonte: WILEY-LISS Publicador: WILEY-LISS
Tipo: Artigo de Revista Científica
Publicado em //1997 EN
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66.06%
Nuclear transfer protocol for the pig using cryopreserved delipated four- to eight-cell and morula stage embryos as nucleus donors was developed. Donor embryos, which had been delipated by micromanipulation following centrifugation for polarizing cytoplasmic lipid droplets, were cryopreserved with 1.5 M 1,2-propanediol and 0.1 M sucrose. Recipient cytoplasts were prepared from ovulated oocytes. Activation of oocytes could be induced more efficiently when electric stimulation was given 53 hr after the hCG injection or later (66-83%), compared with 52 hr or earlier (11-16%, P < 0.05), suggesting that aging after ovulation may be required for in vivo matured porcine oocytes to be activated by electric stimuli. Membrane fusion rates between donor blastomeres and enucleated oocytes were 88% (127/144) and 97% (56/58, P > 0.05) for the four- to eight-cell and morula stage embryos, respectively. In vitro developmental rates to the two-cell (53/100 vs. 35/65), four-cell (34/100 vs. 26/65), and morula stage (17/100 vs. 18/65) were the same between the nuclear transfer embryos with four- to eight-cell and morula nuclei. However, more embryos reconstituted with morula nuclei developed to blastocysts (15% vs. 6%, P < 0.05). These data demonstrated that blastomeres of cryopreserved...

Use of adult mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and blood for somatic cell nuclear transfer in pigs

Faast, R.; Harrison, S.; Beebe, L.; McIlfatrick, S.; Ashman, R.; Nottle, M.
Fonte: Mary Ann Liebert, Inc. Publishers Publicador: Mary Ann Liebert, Inc. Publishers
Tipo: Artigo de Revista Científica
Publicado em //2006 EN
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65.94%
Mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from bone marrow were used to examine the hypothesis that a less differentiated cell type could increase adult somatic cell nuclear transfer (SCNT) efficiencies in the pig. SCNT embryos were produced using a fusion before activation protocol described previously and the rate at which these developed to the blastocyst stage compared with that using fibroblasts obtained from ear tissue from the same animal. The use of bone marrow MSCs did not increase cleavage rates compared with adult fibroblasts. However, the percentage of embryos that developed to the blastocyst stage was almost doubled, providing support for the hypothesis that a less differentiated cell can increase cloning efficiencies. As MSCs are relatively difficult to isolate from the bone marrow of live animals, a second experiment was undertaken to determine whether MSCs could be isolated from the peripheral circulation and used for SCNT. Blood MSCs were successfully isolated from four of the five pigs sampled. These cells had a similar differentiation capacity and marker profile to those isolated from bone marrow but did not result in increased rates of development. This is the first study to our knowledge, to report that MSCs can be derived from peripheral blood and used for SCNT for any species. These cells can be readily obtained under relatively sterile conditions compared with adult fibroblasts and as such...

In vitro development of porcine nuclear transfer embryos constructed using fetal fibroblasts

Verma, P.; Du, Z.; Crocker, L.; Faast, R.; Grupen, C.; McIlfatrick, S.; Ashman, R.; Lyons, I.; Nottle, M.
Fonte: Wiley-Liss Publicador: Wiley-Liss
Tipo: Artigo de Revista Científica
Publicado em //2000 EN
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66.08%
The in vitro development of porcine nuclear transfer embryos constructed using primary cultures from day 25 fetal fibroblasts which were either rapidly dividing (cycling) or had their cell-cycle synchronized in G0/G1 using serum starvation (serum-starved) was examined. Oocyte-karyoplast complexes were fused and activated simultaneously and then cultured in vitro for seven days to assess development. Fusion rates were not different for either cell population. The proportion of reconstructed embryos that cleaved was higher in the cycling group compared to the serum-starved group (79 vs. 56% respectively; P < 0.05). Development to the 4-cell stage was not different using either population. Both treatments supported similar rates of development to the morula (1.5 vs. 7%, cycling vs. serum-starved) and blastocyst stage (1.5 vs. 3%, cycling vs. serum-starved). The blastocyst produced using cycling cells had a total cell number of 10. Total cell numbers for the three blastocysts produced serum-starved cells were 22, 24, and 33. These blastocysts had inner cell mass numbers of 0, 15, and 4, respectively. Six hundred and thirty-five nuclear transfer embryos reconstructed using serum-starved cells were transferred to 15 temporarily mated recipients for 3-4 days. Of these...

Maternal-fetal transplacental leakage of mitochondrial DNA in bovine nuclear transfer pregnancies: potential implications for offspring and recipients

Hiendleder, S.; Bebbere, D.; Zakhartchenko, V.; Reichenbach, H.D.; Wenigerkind, H.; Ledda, S.; Wolf, E.
Fonte: Mary Ann Liebert, Inc. Publishers Publicador: Mary Ann Liebert, Inc. Publishers
Tipo: Artigo de Revista Científica
Publicado em //2004 EN
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66.06%
The synepitheliochorial placenta of ruminants is constructed of multiple tissue layers that separate maternal and fetal blood. In nuclear transfer cloned ruminants, however, placental anomalies such as abnormal vascular development and hemorrhagic cotyledons have been reported. We have investigated the possible exchange of genetic material between somatic cell nuclear transfer cloned (SCNT) bovine fetuses and recipients at day 80 of gestation using mitochondrial DNA (mtDNA) as a marker. Twenty-three recovered SCNT-fetuses and their recipients were screened for divergent and thus informative mtDNA combinations. Twenty-one fetuses generated by in vitro fertilization (IVF) or multiple ovulation embryo transfer (MOET) and the corresponding recipients served as controls. A search for recipient mtDNA haplotype in DNA extracts from fetal blood by PCR-RFLP analysis revealed three cases of chimerism (two SCNT, one IVF) among a total of 19 informative fetus-recipient pairs (eight SCNT, seven IVF, four MOET). Placental anomalies have also been observed in some IVF fetuses and the present data therefore suggests transplacental leakage of cell components or cells from the recipient into some fetuses generated by in vitro techniques. Further studies are necessary to determine (i) the nature of leaked material...

Somatic cell nuclear transfer in the sheep induces placental defects that likely precede fetal demise

Fletcher, C.; Roberts, C.; Hartwich, K.; Walker, S.; McMillen, I.
Fonte: Bio Scientifica Ltd Publicador: Bio Scientifica Ltd
Tipo: Artigo de Revista Científica
Publicado em //2007 EN
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65.98%
The efficiency of cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT) is poor in livestock with ~5% of transferred cloned embryos developing to term. SCNT is associated with gross placental structural abnormalities. We aimed to identify defects in placental histology and gene expression in failing ovine cloned pregnancies to better understand why so many clones generated by SCNT die in utero. Placentomes from SCNT pregnancies (n = 9) and age matched, naturally mated controls (n = 20) were collected at two gestational age ranges (105–134 days and 135–154 days; term = 147 days). There was no effect of cloning on total placental weight. However, cloning reduced the number of placentomes at both gestational ages (105–134 days: control 55.0 ± 4.2, clone 44.7 ± 8.0 and 135–154 days: control 72.2 ± 5.1, clone 36.6 ± 5.1; P < 0.001) and increased the mean individual placentome weight (105–134 days: control 10.6 ± 1.3 g, clone 18.6 ± 2.8 g and 135–154 days: control 6.6 ± 0.6 g, clone 7.0 ± 2.0 g; P < 0.02). Placentomes from cloned pregnancies had a significant volume of shed trophoblast and fetal villous hemorrhage, absent in controls, at both gestational age ranges (P < 0.001) that was shown to be apoptotic by activated caspase-3 immunoreactivity. Consequently...

Cytochalasin B and trichostatin A treatment postactivation improves In Vitro development of porcine somatic cell nuclear transfer embryos

Beebe, L.; McIlfatrick, S.; Nottle, M.
Fonte: Mary Ann Liebert, Inc. Publishers Publicador: Mary Ann Liebert, Inc. Publishers
Tipo: Artigo de Revista Científica
Publicado em //2009 EN
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65.94%
Somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a useful technique for the production of transgenic pigs that can be used for biomedical research. However, the efficiency of SCNT in pigs is low. In this study, we examined the effect of two postactivation treatments, cytochalasin B (CB) and trichostatin A (TSA), on the in vitro development of porcine SCNT embryos. Treating porcine parthenotes with 7.5μg/mL CB for 3h after electrical activation was effective in preventing the extrusion of the second polar body in 65% of the oocytes compared to 17% in the control group. Treating SCNT embryos with CB for 3h after electrical activation significantly increased the average blastocyst cell number compared to the control group (CB treatment 51, Control 34, p<0.05). Treatment of porcine SCNT embryos with CB for 3h and 50nM TSA for 24h after electrical activation resulted in a threefold increase in blastocyst rate (CB+TSA 64%, CB 20%, p<0.05) and an increase in the average blastocyst cell number (CB+TSA 63, CB 46, p<0.05), compared to CB treatment alone. These results show that treatment with TSA and CB significantly improves the in vitro morphological development and quality of porcine SCNT embryos.; Luke F.S. Beebe, Stephen J. McIlfatrick...

The development and ultrastructure of intergeneric nuclear transfer embryos using ovine ooplasm.

Hamilton, Hamish MacDonald
Fonte: Universidade de Adelaide Publicador: Universidade de Adelaide
Tipo: Tese de Doutorado
Publicado em //2005
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66.12%
This thesis encompasses work that aimed to further understand genomic reprogramming, an event crucial in obtaining development in cloned embryos produced by somatic cell nuclear transfer (SCNT). An increasing number of different mammalian species have been cloned using nuclear transfer technology since Dolly the cloned sheep was first successfully produced. However, the biological mechanisms involved in the process of nuclear reprogramming are yet to be fully described. At the centre of this study was an intergeneric SCNT model, which was implemented to determine whether reprogramming factors are conserved across genera. The interaction between donor nucleus and recipient ooplasm was characterised with regard to developmental potential, timing of genome activation, nucleolus formation, and expression of significant proteins. In initial studies, fusion parameters of the intergeneric SCNT procedure were optimised for the ovine cytoplast and porcine donor granulosa cell. Cell fusion and lysis percentages were determined over a range of electrical pulse voltage, duration and repetition. The optimal electrofusion settings were a single DC pulse of 1.5 kV/cm for 20 usec following a 2 sec 400 kHz alignment pulse. In addition, it was demonstrated that ovine oocytes were sensitive to electric stimulation to the extreme that oocyte activation would occur no matter how low the voltage. The practical significance was that it would not be possible to implement a fusion before activation protocol. The ability of the ooplasm of one species to replicate chromosomes and support early embryo cleavage was determined in a preliminary experiment where intergeneric embryos were produced by SCNT using bovine and ovine foetal fibroblasts...

Production of homozygous α-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by breeding and somatic cell nuclear transfer; Production of homozygous alpha-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by breeding and somatic cell nuclear transfer

Nottle, M.; Beebe, L.; Harrison, S.; McIlfatrick, S.; Ashman, R.; O'Connell, P.; Salvaris, E.; Fisicaro, N.; Pommey, S.; Cowan, P.; d'Apice, A.
Fonte: Blackwell Munksgaard Publicador: Blackwell Munksgaard
Tipo: Artigo de Revista Científica
Publicado em //2007 EN
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66.01%
We report here our experience regarding the production of double or homozygous Gal knockout (Gal KO) pigs by breeding and somatic cell nuclear transfer (SCNT). Large White × Landrace female heterozygous Gal KO founders produced using SCNT were mated with Hampshire or Duroc males to produce a F1 generation. F1 heterozygous pigs were then bred to half-sibs to produce a F2 generation which contained Gal KO pigs. To determine the viability of mating Gal KO pigs with each other, one female F2 Gal KO pig was bred to a half-sib and subsequently a full-sib Gal KO. F1 and F2 heterozygous females were also mated to F2 Gal KO males. All three types of matings produced Gal KO pigs. To produce Gal KO pigs by SCNT, heterozygous F1s were bred together and F2 fetuses were harvested to establish primary cultures of Gal KO fetal fibroblasts. Gal KO embryos were transferred to five recipients, one of which became pregnant and had a litter of four piglets. Together our results demonstrate that Gal KO pigs can be produced by breeding with each other and by SCNT using Gal KO fetal fibroblasts.; Mark B. Nottle, Luke F. S. Beebe, Sharon J. Harrison, Stephen M. McIlfatrick, Rodney J. Ashman, Phillip J. O’Connell, Evelyn J. Salvaris, Nella Fisicaro, Sandra Pommey...

Uso de agentes modificadores de cromatina na transferência nuclear de células somáticas em bovinos; Use of chromatin modifying agents in bovine somatic cell nuclear transfer

Sangalli, Juliano Rodrigues
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Dissertação de Mestrado Formato: application/pdf
Publicado em 13/12/2011 PT
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Embora a transferência nuclear de células somáticas (TNCS) seja uma ferramenta promissora, seu amplo uso é impedido devido às altas taxas de mortalidade durante o desenvolvimento dos animais clonados. Acredita-se que a reprogramação epigenética anormal seja a principal causa desta baixa eficiência. Nós hipotetizamos que agentes modificadores de cromatina (AMCs) atingindo a acetilação das histonas e a metilação do DNA poderiam alterar a configuração da cromatina e torná-la mais facilmente reprogramável. Deste modo, fibroblastos bovinos foram tratados com 5-aza-2\'-deoxicitidina (AZA) mais tricostatina A (TSA) ou hidralazina (HH) mais ácido valpróico (VPA) enquanto, em outro experimento, zigotos bovinos clonados foram tratados com TSA. O tratamento dos fibroblastos com AZA+TSA ou HH+VPA aumentou a acetilação das histonas, mas não afetou o nível de metilação do DNA. Entretanto, o tratamento com HH+VPA diminuiu a viabilidade/proliferação celular. O uso destas células como doadoras de núcleo não mostrou efeitos positivos sobre o desenvolvimento pré- e pós-implantação. Em relação ao tratamento dos zigotos clonados com TSA, o tratamento destes mostrou um aumento nos padrões de acetilação das histonas...

Patologia de neonatos bovinos originados por meio da técnica de transferência nuclear de células somáticas: clonagem; Pathology of bovine neonates generated by somatic cell nuclear transfer: Cloning

Santos, Caio Rodrigues dos; Grandi, Fabrizio; Miglino, Maria Angélica; Meirelles, Flávio Vieira; Maiorka, Paulo César
Fonte: Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Publicador: Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
Tipo: info:eu-repo/semantics/article; info:eu-repo/semantics/publishedVersion; ; ; ; ; ; Formato: application/pdf
Publicado em 01/01/2010 POR
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Os mecanismos de morte em animais clonados a partir de células somáticas são poucos elucidados. Malformações de órgãos, alterações de tamanho e peso desses animais foram anomalias já descritas, porém em casos isolados. Desse modo, estudos nos níveis anatomo e histopatológicos são de suma importância para ajudar a compreensão dos fatores responsáveis pelos altos índices de insucessos com a utilização da TNCS (transferência nuclear de células somáticas). Assim, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de descrever, por meio de exames anatomopatológicos, as alterações presentes em um grupo de animais gerados por TNCS, que vieram a óbito entre 1 e 19 dias de vida. Esse experimento foi realizado entre os anos de 2004 e 2008 na fazenda Tambaú, cidade de Tambaú, Estado de São Paulo. No total foram gerados 21 animais da raça Nelore (Bos indicus), sendo que 11 vieram a óbito e dez apresentaram boa evolução clínica no período perinatal. Foram realizadas as necropsias dos animais e posterior análise histopatológica de tecidos alterados. Esse estudo mostrou alta prevalência de alterações cardiopulmonares, que provavelmente foram determinantes nos mecanismos de morte dos animais. Dentre essas alterações a hipertensão pulmonar e modificações hemodinâmicas diagnosticadas através do exame histopatológico foram as mais frequentes.; The death mechanisms in cloned animals are not well elucidated. There are few cases describing organ malformation...