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Mapping the Molecular Determinants of Positive Allosteric Modulators of the mGlu2 Receptor

Russo, Belisa das Neves
Fonte: Universidade de Coimbra Publicador: Universidade de Coimbra
Tipo: Dissertação de Mestrado
ENG
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26.91%
Glutamato é o principal neurotransmissor excitatório no cérebro, sendo bastante importante em várias funções do sistema nervoso central. Alterações no sistema glutamatérgico estão envolvidas em doenças como esquizofrenia e ansiedade. Tem vindo a ser demonstrado que a activação de receptores mGlu2 reduz a transmissão glutamatérgica nas regiões cerebrais associadas a estas doenças. Por esta mesma razão, a activação destes receptores tem sido alvo de investigação para desenvolvimento de novas técnicas terapêuticas, especialmente com o uso de modeladores alostericos positivos (PAMs); estes modeladores ligam-se a uma zona do receptor diferente do local de ligação do glutamato. Dado que a área de estudo dos PAM do receptor mGlu2 se encontra em expansão e o primeiro ensaio clínico está a decorrer é bastante importante obter mais informacão sobre o correcto local de ligacão destes ligandos. Esta informacão também pode suportar e facilitar os esforços da investigação química. Com o objectivo de identificar os aminoácidos responsáveis pela interação entre os PAMs e o receptor mGlu2, foi efectuada modulação molecular e docking de PAMs de receptores mGlu2 em paralelo com mutagénese dirigida. Nos receptores mGlu2 mutantes foi avaliado o impacto das mutações na actividade e afinidade dos PAMs. Este estudo confima a importância de aminoácidos previamente demonstrados como importantes na actividade de PAMs estruturalmente diferentes nestes receptores. É tambem demonstrado que adicionais aminoácidos seleccionados com base na comparação de sequencias entre mGlu2/3 parecem não ser importantes na actividade dos PAMs. A informação obtida neste estudo tambem demonstra que a actividade dos modeladores testados é reduzida devido à diminuição da afinidade de ligação. Toda esta informação oferece um melhor entendimento sobre o ‘binding pocket’ para PAMs do receptor mGlu2.; Glutamate is the major excitatory neurotransmitter in the brain and plays an important role in a wide variety of central nervous system functions. Alterations in the glutamatergic system are involved in disorders like schizophrenia and anxiety. It has been shown that activation of the metabotropic glutamate 2 receptor reduces the glutamatergic transmission in brain regions associated with these disorders. Therefore...

Mapping the molecular determinants of positive allosteric modulators of the mGlu2 recepto

Farinha, Ana Isabel
Fonte: Universidade de Coimbra Publicador: Universidade de Coimbra
Tipo: Dissertação de Mestrado
ENG
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26.91%
O sucesso dos receptores acoplados à proteína G (GPCRs) enquanto alvos terapêuticos para o tratamento de doenças do sistema nervoso central torna estes receptores alvos pertinentes de investigação. Especificamente, a activação de receptores mGlu2 tem mostrado reduzir a transmissão glutamatérgica em áreas do cerebro onde o excesso de sinalização glutamatérgica parece estar implicado na patofisiologia de doenças como a ansiedade e a esquizofrenia. Deste modo, a activação dos receptores mGlu2 está actualmente a ser encarada como uma potencial estratégia para o tratamento destas doenças. Diversos moduladores alostéricos positivos (PAMs), que se ligam a um local do receptor diferente do local de ligação do glutamato, têm revelado modular os receptores mGlu2 de uma forma selectiva. Com o objectivo de identificar aminoácidos potencialmente importantes para a interacção entre o PAM e o receptor mGlu2, foi efectuada a modelação molecular e o docking de PAMs de receptores mGlu2 em paralelo com mutagénese dirigida. Receptores mGlu2 mutantes foram produzidos e o impacto dessas mutações na actividade de diversos PAMs foi avaliado, de forma a confirmar o papel destes aminoácidos na actividade destes compostos. Este estudo identifica aminoácidos importantes para a actividade dos PAMs e sugere um potencial local de ligação destes compostos.; The proven success of G protein-coupled receptors (GPCRs) as drug targets for the treatment of CNS disorders renders them attractive targets of research. Specifically...

Mutagenesis in Petunia x hybrida Vilm. and isolation of a novel morphological mutant; Mutagênese em Petunia x hybrida Vilm. e isolamento de um novo mutante morfológico

BERENSCHOT, Amanda S.; ZUCCHI, Maria I.; TULMANN-NETO, Augusto; QUECINI, Vera
Fonte: Sociedade Brasileira de Fisiologia Vegetal Publicador: Sociedade Brasileira de Fisiologia Vegetal
Tipo: Artigo de Revista Científica
ENG
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37.35%
Traditionally, mutagenesis has been used to introduce novel genetic variability in ornamental crops. More recently, it has become a powerful tool in gene discovery and functional analyses in reverse genetics approaches. The present work aimed to compare the efficiency of physical and chemical agents in generating mutant populations of petunia. We have indirectly evaluated the genomic damage by analyzing developmental characteristics of the plantlets derived from treated seeds employing gamma radiation at 0, 20, 40, 60, 80 and 100 Gy and the alkylating agent ethyl-methanesulfonate (EMS) at 0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2 and 0.25% (v/v). Gamma rays and EMS caused developmental defects and decreased seedling viability in plants obtained from the mutagenized seeds. High mutagen doses reduced in approximately 44% the number of plants with primary leaves at 15 days after sowing (DAS) and decreased seedling survival rates to 55% (gamma) and 28% (EMS), in comparison to untreated controls. Seedling height decrease was proportional to increasing EMS dosage, whereas 40 and 60 Gy of gamma irradiation caused the most significant reduction in height. Moderate DNA damage allowing a high saturation of mutant alleles in the genome and the generation of viable plants for reverse genetics studies was correlated to the biological parameter LD50...

Mutagênese e tecnologia in vitro no melhoramento genético da pimenta-do-reino (Piper nigrum L.).; Mutagenesis and in vitro technology in the genetic improvement of black pepper (Piper nigrum L.).

Lemos, Oriel Filgueira de
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Tese de Doutorado Formato: application/pdf
Publicado em 28/02/2003 PT
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37.18%
O presente trabalho teve por objetivo desenvolver tecnologia in vitro e associá-la à mutagênese, e avaliar plantas V 5 e V6 quanto aos caracteres agronômicos de produção em área de ocorrência da doença fusariose, visando ao melhoramento genético da pimenta-do-reino para obtenção de plantas tolerantes e/ou resistentes à doença fusariose. A aplicação das técnicas in vitro iniciou-se através da obtenção de plantas doadoras de explantes, a partir de estacas em casa-de-vegetação e, de sementes e embriões zigóticos in vitro. O processo de micropropagação foi desenvolvido a partir de gemas de plantas obtidas in vitro através do estabelecimento de condições adequadas de cultivo em meios de cultura apropriados para multiplicação de gemas, enraizamento e obtenção de "plantlets", e de tipo de substrato para aclimatação e formação de mudas. Após a definição deste processo, gemas de plantas de casa-de-vegetação foram submetidas a diferentes tratamentos de assepsia e as sobreviventes micropropagadas. Seleção in vitro foi estabelecida ao cultivar isolados patogênicos do fungo Fusarium solani f. sp. piperis em meio Czapek-Dox e, através da curva de crescimento foi estabelecido o período de 28 dias de cultivo mais adequado para obtenção de filtrado da cultura do fungo. Diferentes concentrações de filtrado e formas de esterilização foram testadas em meio de cultura de multiplicação de gemas e determinou-se a concentração de 55% do filtrado do fungo (v/v) sob a esterilização por duas autoclavagens...

Estudo dos efeitos mutagênicos da poluição ambiental em trabalhadores de rua em São Paulo; Air pollution significantly influences mutagenesis in the oral mucosa: a study in inhabitants of Sao Paulo, Brazil

Negri, Ariadini
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Tese de Doutorado Formato: application/pdf
Publicado em 23/10/2009 PT
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27.35%
A poluição atmosférica vem recebendo crescente atenção como problema de saúde pública, pois representa uma fonte de agentes que podem promover o stress oxidativo e danos ao DNA, levando a efeitos cancerígenos e mutagênicos. As vias aéreas superiores, incluindo a cavidade oral são as áreas mais expostas do sistema respiratório, a material particulado e gases, e podem ser facilmente acessadas para monitorar a exposição humana a estes agentes. Nosso objetivo foi analisar o impacto da poluição do ar sobre a incidência de mutagénese em habitantes de nossa cidade. Para o estudo da mutagênese, utilizamos o teste de micronucleous (Mn), em células do epitélio da mucosa oral. Uma média de 4 a 6 amostras foram coletadas de cada voluntário, que concordou em participar do estudo, em São Paulo (SP) (n = 39) e, em Peruibe (PER), uma pequena cidade à beira-mar (n = 24), utilizados como um grupo controle. Os níveis de material particulado (PM10) foram medidos pelo método gravimétrico, e o ozônio e NO2 foram medidos pelos amostradores passivos, bem como pelas medições realizadas pela CETESB no mesmo local da coleta. Os resultados expostos em relação à concentração de MN / células, mostraram uma diferença estatisticamente significativa comparando SP (0042 ± 0032) e Per (0023 ± 0019)...

Bases moleculares da especificidade pelo substrato em β-glicosidases; Molecular bases of the specificity substrate of a β-glicodase

Mendonça, Lúcio Mário Ferreira de
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Tese de Doutorado Formato: application/pdf
Publicado em 06/11/2009 PT
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27.18%
β-glicosidases da família 1 das glicosídeo hidrolases (GH 1) são um dos mais importantes grupos de enzimas, estando envolvidas em diversos processos biológicos. Neste trabalho o objetivo principal foi o estudo das bases moleculares da especificidade pelo substrato em β-glicosidases GH 1 utilizando como modelo experimental uma β-glicosidase pertencente a larva de Spodoptera frugiperda (Sfβgli50). Na primeira etapa procurou-se analisar através de mutagênese sítio-dirigida e cinética enzimática o papel na modulação da especificidade pelo substrato e na catálise dos resíduos E190, E194, K201 e M453 da Sfβgli50 , os quais correspondem aos encontrados no sítio de ligação do aglicone das β-glicosidases de milho e de sorgo. Os resultados mostraram que E190 favorece a ligação da porção inicial de aglicones do tipo alquil inicial e também da primeira unidade de glicose de aglicones oligossacarídicos. E194 favorece a ligação de radicais alquil, enquanto K201 é mais relevante para a ligação de unidades de glicose em detrimento de radicais alquil. O balanço entre as interações com E194 e K201 determina a preferência entre unidades de glicose versus radicais alquil. M453 favorece a ligação da segunda unidade de glicose de aglicones oligossacarídicos e também da porção inicial de aglicones do tipo alquil. Nenhum destes resíduos interage com a porção terminal de aglicones do tipo alquil. Demonstrou-se que todos estes resíduos contribuem de forma similar e individualmente fraca na estabilização do complexo ES‡ e suas interações com o aglicone não influenciam na ligação do glicone. Na segunda etapa...

Sequenciamento de um código de barras como ferramenta para quantificação de alterações na dinâmica de populações celulares transduzidas com vetores lentivirais.; Sequencing of a barcode as a tool for the quantification of changes in the dynamics of cell populations transduced with lentiviral vectors.

Zanatta, Daniela Bertolini
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Tese de Doutorado Formato: application/pdf
Publicado em 28/06/2012 PT
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27.18%
Os vetores retrovirais representam uma das melhores opções para transferência e terapia gênica, pois fornecem expressão do transgene em longo prazo. Entretanto, a inserção do provírus pode causar mutagênese insercional, induzindo proto-oncogenes. Eventos deste tipo têm sido descritos em protocolos clínicos para o tratamento de SCID-X1, doença granulomatosa crônica e talessemia beta, quando vetores retrovirais (oncorretrovirus) foram utilizados. Atualmente, existem poucos métodos simples e rápidos para revelar e quantificar a expansão clonal. Assim, descrevemos a construção uma biblioteca de vetores contendo uma marcação aleatória, denominada código de barras. O sequenciamento do código de barras permitirá revelar, caracterizar e até quantificar a expansão clonal de uma população de células transduzidas. Esta metodologia ajudará a testar novos arranjos de promotores e genes terapêuticos, para o desenvolvimento de vetores mais seguros contribuindo para a redução da probabilidade de um evento de proliferação clonal desencadeado pela mutagênese insercional.; Retroviral vectors represent one of the best options for gene transfer and therapy, where long-term transgene expression is required. However, insertion of the provirus can cause insertional mutagenesis...

Estudo dos efeitos mutagênicos do tabagismo passivo em cães; Mutagenic effects of passive smoking in pet dogs

Moralles, Érika Negri
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Dissertação de Mestrado Formato: application/pdf
Publicado em 22/04/2014 PT
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27.18%
O cigarro é considerado pela Organização Mundial de Saúde como o maior agente de poluição ambiental doméstica atualmente. Muitos estudos têm analisado os efeitos do tabagismo passivo em seres humanos, mas pouco tem sido estudado em animais domésticos, assim como crianças, são os mais afetados pelo tabagismo passivo. O presente estudo busca correlacionar o exposição ao fumo passivo com a incidência de mutagênese através do teste da presença de micronúcleos nas células epiteliais da mucosa oral de cães expostos. Paralelamente, foi estudada a possível correlação desde dado com o nível de dependência à nicotina do proprietário, avaliada pelo teste de Fagerstrom. Para a avaliação da mutagênese, esfregaços da mucosa oral foram colhidos de 48 cães, 23 fumantes passivos e 25 não expostos. O número de micronúcleos por celula foi avaliado em todas as amostras. Os dados mostram que a incidência de micronúcleos foi estatisticamente maior nos animais fumantes passivos comparado com o controle (p < 0,001). Além disso, nos animais dos proprietários com escore 8 (dependência de nicotina muito alta) no Teste de Fagerstrom, a quantidade de micronúcleos foi significativamente maior do que nos animais de proprietários com escore 6 (alta dependência). Da mesma forma...

Caracterização da mutagênese por inserção do retrotransposon Tos17 em genótipos de arroz

Ferreira, Flavia Vanina
Fonte: Universidade Federal do Rio Grande do Sul Publicador: Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Tipo: Dissertação Formato: application/pdf
POR
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37.18%
O aumento do potencial produtivo da cultura de arroz via melhoramento genético está principalmente relacionado ao rendimento, a qualidade de grãos e a obtenção de plantas resistentes a doenças e pragas. Neste caso, deve ser explorada a variabilidade genética natural ou induzida através de agentes mutagênicos físicos, químicos ou biológicos. A vantagem do uso de mutagênicos biológicos, como os transposons e os retrotransposons, é que ao serem inseridos podem interrompem um gene causando uma mutação. Esta retrotransposição deixa uma marca que possibilita a identificação molecular do local de inserção. No presente trabalho, foi utilizada a estratégia de mutagênese insercional através de eventos de transposição do retrotransposon Tos17, induzido por cultura in vitro. A análise de diferentes genótipos de arroz é muito importante para avaliar se a transposição ocorre de forma similar em genótipos distintos. Foram avaliados calos embriogênicos de cultivares que têm um histórico de variabilidade genética em homozigose, linhagens obtidas através de cruzamentos com espécies silvestres e ecótipos de arroz vermelho, submetidos a 6 meses de cultura in vitro. O método escolhido para avaliar o número de cópias de Tos17 em calos embriogênicos foi a quantificação relativa por PCR em tempo real. A identificação dos genes mutados pela inserção do retrotransposon foi feita através do isolamento e amplificação das seqüências que flanqueiam os insertos de Tos17. O resultado deste experimento indica um aumento no número de cópias de Tos17 em 8 dos 21 genótipos avaliados. O seqüenciamento dos fragmentos de DNA que flanqueiam os insertos do retrotransposon Tos17...

Estudos de complementação fenotípica do mutante pso2-1 de Saccharomyces cerevisiae pelos genes uvr de Escherichia coli

Lenzi, Cassius Frosi
Fonte: Universidade Federal do Rio Grande do Sul Publicador: Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Tipo: Dissertação Formato: application/pdf
POR
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27.18%
O mecanismo de reparação de DNA por excisão de nucleotídeos (NER) é o mais universal e conservado sistema de reparação encontrado em organismos procarióticos e eucarióticos. Em bactérias, a via NER é mediada pelos produtos dos genes uvrA, uvrB e uvrC, conhecido como complexo UvrABC. A atuação das proteínas Uvr pode ser dividida em quatro passos básicos: reconhecimento do dano e verificação da lesão; incisão; excisão do fragmento danificado; síntese de reparo e ligação. O mutante pso2-1 de Saccharomyces cerevisiae foi um dos primeiros mutantes isolados sensíveis especificamente aos tratamentos com agentes indutores de pontes intercadeias (ICLs), tais como 8-MOP+UVA e mustarda nitrogenada (HN2). O exato mecanismo de participação da proteína Pso2p no reparo de ICLs ainda permanece desconhecido e, portanto, a continuidade da sua caracterização é essencial para compreender melhor os mecanismos e produtos gênicos envolvidos na reparação de ICLs em S. cerevisiae. Além disso, alguns estudos recentes com os mutantes de Escherichia coli uvrA, uvrB e uvrC mostraram uma hipersensibilidade do mutante uvrB à 8-MOP + UVA, bem como a incapacidade de reconstituir DNA de alta massa molecular, característica esta semelhante ao fenótipo do mutante pso2-1 de S. cerevisiae. Neste trabalho...

Fator σ [Sigma] de Mycoplasma hyopneumoniae : mutagênese, clonagem e expressão

Weber, Shana de Souto
Fonte: Universidade Federal do Rio Grande do Sul Publicador: Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Tipo: Dissertação Formato: application/pdf
POR
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37.18%
Mycoplasma hyopneumoniae (MH) é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial causando importantes perdas econômicas. Recentemente, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo três cepas de MH. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam o início da transcrição nestes microrganismos. Assim como em outras espécies deste gênero, M. hyopneumoniae não possui vários mecanismos que regulam a expressão gênica, incluindo o sistema de dois componentes e diversos fatores σ. Portanto, aparentemente, os sinais que promovem e regulam a transcrição, nestes organismos, devem diferir significativamente de outras bactérias. Além disso, o baixo conteúdo de GC e a falta de promotores experimentalmente caracterizados, também são fatores que dificultam o reconhecimento de seqüências controladoras. Para possibilitar a identificação das seqüências promotoras de MH in vitro, através da utilização da RNA polimerase holoenzima reconstituída...

A Chiquimato desidrogenase de Mycobacterium tuberculosis : mutagênese sítio-direcionada, expressão, purificação e caracterização da enzima mutante K69A

Rodrigues Junior, Valnes da Silva
Fonte: Universidade Federal do Rio Grande do Sul Publicador: Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Tipo: Dissertação Formato: application/pdf
POR
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37.46%
As enzimas da via do chiquimato são alvos atraentes para o desenvolvimento de agentes para tratar a tuberculose já que esta via é essencial para Mycobacterium tuberculosis e está ausente em humanos. A enzima chiquimato desidrogenase de M. tuberculosis (MtbSD), codificada pelo gene aroE, catalisa a quarta reação na via do chiquimato. Estudos de estrutura tridimensional, de perfis de pH e de mutagênese sítio-direcionada envolvendo muitas chiquimato desidrogenases sugerem a participação da Lisina-69 e do Aspartato-105 (numeração de acordo com a seqüência da MtbSD) na catálise e/ou na ligação ao substrato. A determinação das propriedades cinéticas de enzimas mutantes pode permitir importantes proposições acerca do papel destes resíduos para a enzima MtbSD. A mutagênese foi realizada usando uma técnica de amplificação por PCR para as seguintes proteínas mutantes: K69A, K69H, K69I, K69Q, D105A, D105N. Testes de diversas condições experimentais foram feitos para obter a expressão das proteínas MtbSD mutantes na fração solúvel. Além disso, empregamos um protocolo de purificação otimizado para obter as enzimas MtbSD não mutante e K69A aparentemente homogêneas. Realizamos ensaios cinéticos em estado estacionário e medidas espectrofluorimétricas destas duas enzimas...

Confecção e seleção in vitro de mutantes com virulência atenuada de cepa apec por mutagênese marcada com assinatura

Pavanelo, Daniel Brisotto
Fonte: Universidade Federal do Rio Grande do Sul Publicador: Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Tipo: Trabalho de Conclusão de Curso Formato: application/pdf
POR
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37.18%
A Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é o principal agente da colibacilose aviária. Ainda não há um patotipo estabelecido para APEC, mas diversos genes associados à virulência já foram descritos para essa bactéria. Dentre as diversas cepas estudadas de APEC, destaca-se a MT 78, que possui 20 de 33 fatores associados à virulência testados, causa morte celular em macrófagos aviários e é capaz de invadir células não-fagocitárias (fibroblastos aviários de linhagem). Para investigar qual gene da MT 78 é essencial para que a cepa invada células não-fagocitárias, foi construída uma biblioteca de 1800 mutantes dessa cepa, através da técnica de mutagênese marcada com assinatura (STM). Foram feitos ensaios de invasão com metade dos mutantes (900); a outra metade também será testada. Os ensaios consistem na infecção de fibroblastos aviários de linhagem e recuperação das bactérias intracelulares após 4 horas; o DNA dos mutantes será extraído e será possível detectar quais os mutantes presentes na infecção e ausentes na recuperação dos experimentos. Esses mutantes serão investigados devido à perda da capacidade de invasão. Será possível descobrir qual(is) o(s) gene(s) que sofreu(ram) mutação...

Padronização da técnica de mutagênese marcada com assinatura para obtenção de mutantes de Escherichia coli patogênica aviária com virulência atenuada

Pavanelo, Daniel Brisotto
Fonte: Universidade Federal do Rio Grande do Sul Publicador: Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Tipo: Dissertação Formato: application/pdf
POR
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37.18%
Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é o agente etiológico da colibacilose, doença que acomete galinhas, patos, perus e outras aves, principalmente entre a 2ª e a 12ª semana de vida. Existem diversos estudos sobre genes associados à virulência de APEC, mas eles ainda não são capazes de explicar todos os fenótipos de APEC. Portanto, outros genes associados à virulência – ainda não descritos – devem estar presentes em APEC. Para descobrir novos genes associados à virulência em APEC, uma cepa invasiva foi usada para a construção de uma biblioteca de 1.800 mutantes, através da técnica de mutagênese marcada com assinatura, que insere transposons aleatoriamente no genoma da bactéria. Os mutantes foram selecionados em um ensaio de invasão in vitro a fibroblastos aviários da linhagem CEC-32. A sequência dos transposons inseridos nos mutantes permite a identificação daqueles mutantes que não foram capazes de invadir os fibroblastos. Até agora, 11 de 20 pools de 90 mutantes cada foram analisados, e 48 mutantes parecem ter perdido a capacidade invasiva, ou seja, tiveram sua virulência atenuada. Os demais pools já foram selecionados e terão seu DNA analisado. Todos mutantes que possivelmente perderam sua capacidade invasiva serão testados novamente para confirmar seu fenótipo de virulência atenuada. Depois...

Obtenção de mutantes de Streptomyces clavuligerus e avaliação de condições de cultivo para a melhoria de produção de cefamicina C

Antonio, Tatiana
Fonte: Universidade Estadual Paulista (UNESP) Publicador: Universidade Estadual Paulista (UNESP)
Tipo: Tese de Doutorado Formato: 62 f. : il. -
POR
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27.18%
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Pós-graduação em Biotecnologia - IQ; Mutantes foram obtidos através de tratamento mutagênico dos esporos de S. clavuligerus ATCC 27064 com metil-metanosulfonato. Um total de 822 colônias, obtidas por repiques sucessivos, foram selecionadas em testes qualitativos e/ou quantitativos. O melhor mutante S. clavuligerus 45.41, mostrou-se de duas a quatro vezes mais produtivo que a linhagem selvagem, e manteve-se estável após 35 repiques sucessivos ao longo deste estudo. O comportamento das linhagens foi investigado pela adição de diferentes diaminas ao meio de cultivo, uma a uma, na ausência de lisina. Também se investigou duas fontes distintas de C, além de compostos como o ácido 2,6- diaminopimélico. Um planejamento de dois fatores (cadaverina e lisina), três níveis, baseado no ponto central, faces centradas, indicou que a adição de lisina aumenta a produção de CefC para ambas as linhagens. O efeito positivo da cadaverina foi observado principalmente na linhagem mutante 45.41. Resultados obtidos em processo de batelada, em biorreator de bancada confirmaram as diferenças observadas entre as linhagens nos cultivos em frascos agitados. Procedimento de mutagênese clássica foi utilizado em conjunto com critérios bem definidos para se estabelecer um meio de cultura apropriado...

Engineering new bacterial dye-decolourising peroxidases for lignin degradation

Tavares, Diogo Alexandre Martins Aires, 1991-
Fonte: Universidade de Lisboa Publicador: Universidade de Lisboa
Tipo: Dissertação de Mestrado
Publicado em //2014 ENG
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27.61%
Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014; Dye-decolourising peroxidases (DyPs) are a novel family of heme-containing peroxidases showing a high efficiency for a wide number of substrates, including synthetic dyes, lignin units and metals, and are thus very attractive biocatalysts for application in the environmental and industrial biotechnology fields. In this work high-throughput protocols were optimized and validated for the application of directed evolution approaches targeting PpDyP from Pseudomonas putida MET94 at the level of cell growth, lysis and enzymatic assays. Libraries of variants were created by epPCR and DNA shuffling techniques and explored for activity using high-throughput screenings activity assays. Four libraries of variants in a total of 8163 clones were explored in three rounds () of molecular evolution rounds to improve the efficiency for substrates and stability of PpDyP. The best variants were overproduced and purified and their structural and catalytic properties were characterized by spectroscopic and kinetic approaches. One variant, 21G11, was achieved showing 25- and 6-fold higher specificities (kcat/Km) for ABTS oxidation and H2O2 reduction...

Padrão de integração de pAN7-1 em mutantes de Magnaporthe grisea com patogenicidade alterada em arroz

Marchi,Carlos Eduardo; Brommonschenkel,Sérgio Hermínio; Queiroz,Marisa Vieira de; Borges,Mírian de Freitas; Mizubuti,Eduardo Seiti G.
Fonte: Grupo Paulista de Fitopatologia Publicador: Grupo Paulista de Fitopatologia
Tipo: Artigo de Revista Científica Formato: text/html
Publicado em 01/03/2010 PT
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27.35%
Ensaios foram conduzidos para verificar a presença, o número de cópias e de sítios de integração de pAN7-1 no genoma de mutantes de M. grisea I-22 com patogenicidade alterada em arroz. Foram analisados T41, T93, T251 (gerados por mutagênese REMI) e T108 (oriundo de mutagênese convencional), os quais exibiram diferentes fenótipos mutantes. O DNA total desses mutantes foi submetido à reação em cadeia de polimerase (PCR) e às análises de hibridização com o vetor (Southern blot). A presença de pAN7-1 no genoma de todos os mutantes foi confirmada por PCR. Segundo as análises de Southern blot, T41 exibiu duas integrações do vetor, ambas na forma de cópia única. No genoma de T93 também foram detectados dois sítios de inserção de pAN7-1, um dos quais envolvendo múltiplas cópias do vetor. Os resultados indicaram a presença de apenas uma cópia do vetor em um único sítio nos genomas de T108 e T251. O padrão de integração em T251 foi o único a sugerir a ocorrência de evento REMI. As diferenças quanto ao tamanho dos fragmentos com homologia a pAN7-1 refletiram a possível aleatoriedade dos eventos de integração no genoma de M. grisea. Os resultados evidenciaram o potencial de REMI para a mutagênese insercional de M. grisea...

Mutagênese e tecnologia in vitro no melhoramento genético da pimenta-do-reino (Piper nigrum L.).

LEMOS, O. F. de.
Fonte: 2003. Publicador: 2003.
Tipo: Teses/dissertações (ALICE) Formato: il.; 159 f.
PT_BR
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37.18%
Desenvolver tecnologia in vitro e associá-la à mutagênese, e avaliar plantas V5 e V6 quanto aos caracteres agronômicos de produção em área de ocorrência da doença fusariose, visando ao melhoramento genético da pimenta-do-reino para obtenção de plantas tolerantes e/ou resistentes à doença fusariose. A aplicação das técnicas in vitro iniciou-se através da obtenção de plantas doadoras de explantes, a partir de estacas em casa-de-vegetação e, e de sementes e embriões zigóticos in vitro. O processo de micropropagação foi desenvolvido a partir de gemas de plantas obtidas in vitro através de estabelecimento de condições adequadas de cultivo em meios de cultura apropriados para multiplicação de gemas, enraizamento e obtenção de "plantlets", e de tipo de substrato para aclimatação e formação de mudas. Após a definição deste processo, gemas de plantas de casa-de-vegetação foram submetidas a diferentes tratamentos de assepsia e as sobreviventes micropropagadas. Seleção in vitro foi estabelecida ao cultivar isolados patogênicos do fungo Fusarium solani f.sp. piperis em meio Czapek-Dox e, através da curva de crescimento foi estabelecido o período de 28 dias de cultivo mais adequado para obtenção de filtrado da cultura do fungo.; 2003; Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz...

Arbeiten zur Erythrozyteninvasion von Bartonella tribocorum; The invasion of erythrocytes by Bartonella tribocorum

Gille, Christian
Fonte: Universidade de Tubinga Publicador: Universidade de Tubinga
Tipo: Dissertação
DE_DE
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Bartonellen sind fakultativ intrazelluläre Bakterien, die hämotroph den Menschen und viele Säugetiere besiedeln können. Ein Charakteristikum des Infektionsverhaltens von Bartonella spezies ist die bisher nur für diese Bakterien bekannte Fähigkeit zur Invasion in Erythrozyten. Viele andere intrazellulär auftretende Bakterien invadieren über die Induktion eines endozytotischen Vorgangs in die Wirtszelle, ein Prozeß, für den ein aktives Zytoskelett der Wirtszelle erforderlich ist. Dieses ist beim Erythrozyten nicht vorhanden. Da über den Mechanismus der Erythrozyteninvasion von Bartonella spezies bisher nichts bekannt ist, war ein Beitrag zur Klärung Gegenstand dieser Arbeit. In der vorliegenden Arbeit wurde ein in vivo-Infektionsmodell für einen GFP-tragenden Klon von B. tribocorum 506T (B. tribocorum -gfp) in der Ratte etabliert. Es konnte durch intravenöse Injektion von B. tribocorum-gfp eine klinisch asymptomatische Bakterämie der Versuchstiere erzeugt und eine präbakterämische Initiationsphase, eine bakterämische Expansionsphase sowie die Phase der Persistenz / Elimination beobachtet werden. In der präbakterämischen Phase fanden sich Hinweise für eine spezifische oder unspezifische Akkumulation der injizierten Bakterien in der Leber. Während der bakterämischen Phasen konnte die intraerythrozytäre Lokalisation durch FACS-Analysen und Laser-Scanning-Mikroskopie nachgewiesen werden...

Melhoramento genético da levedura oleaginosa Lipomyces starkeyi por mutagênese aleatória, visando a produção de biocombustíveis de segunda geração; Genetic improvement of oleaginous yeast Lipomyces starkeyi through random mutagenesis, order to produce of second generation of biofuels

Eulalia Vargas Tapia
Fonte: Biblioteca Digital da Unicamp Publicador: Biblioteca Digital da Unicamp
Tipo: Dissertação de Mestrado Formato: application/pdf
Publicado em 31/07/2012 PT
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Neste trabalho foram desenvolvidos estudos visando o melhoramento genético da linhagem de levedura Lipomyces starkeyi DSM 70296, visando sua utilização na biossíntese de precursores de biocombustíveis a partir de fontes renováveis. Inicialmente foram verificados os parâmetros de mutagênese. O melhoramento genético foi conduzido por mutagênese aleatória de DNA por irradiação ultravioleta. O tempo de exposição foi ajustado de forma a assegurar uma taxa de sobrevivência celular não superior a 5%, para obter indivíduos contendo elevado acúmulo de mutações no DNA. Os mutantes foram selecionados com o uso da cerulenina agente interferente ao metabolismo de interesse, de forma que fossem identificados os mutantes cujas alterações genéticas pudessem estar promovendo efeitos sobre este metabolismo. Os mutantes que demonstraram crescimento normal em meio de cultura suplementado com cerulenina foram considerados bons candidatos para estudos aprofundados. Nesta etapa foram selecionados 90 mutantes, dos quais foram selecionados os oito melhores candidatos para estudo através de fermentação em frascos agitados. A avaliação de desempenho fermentativo foi conduzida a partir da avaliação dos índices de crescimento e produtividade de lipídeo utilizando meio de cultura contendo xilose como única fonte de carbono. A fermentação da cepa padrão foi conduzida nas mesmas condições para permitir uma análise comparativa. Os resultados obtidos mostraram que um dos mutantes (identificado como A1) apresentou aumento significativo nos índices de produtividade de biomassa e lipídeo em relação à cepa padrão (teste de Tukey com 95% de significância). Este mutante foi então selecionado para estudo aprofundado através da fermentação em biorreator utilizando a mesma composição de açúcares observada em bagaço de cana-de-açúcar (30% glicose: 70% xilose)...