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A doença de Parkinson (PD) é uma perturbação cerebral e prolongada que se caracteriza pelo inclusão de corpos de Lewy (LB) e pela degeneração dos neurónios dopaminérgicos da substância nigra pars compacta (SNpc) até ao estriado. É a segunda doença neurodegenerativa mais comum e tem como principais sintomas a dificuldade em controlar os movimentos voluntários, movimentos lentos, tremor, rigidez, instabilidade postural e demência. Actualmente, a patogênese da PD não está totalmente clarificada mas alguns estudos têm sugerido que o envelhecimento, factores ambientais e genéticos desempenham um papel preponderante para o desenvolvimento da doença. Mais recentemente, estudos genéticos têm descrito várias mutações no gene Leucine- Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) que causam PD do tipo autossómico dominante com início tardio sendo clinicamente impossível diferenciar da PD idiopática. De facto, as mutações no gene LRRK2 são responsáveis por 5-10% dos casos familiares e 1-2% dos casos esporádicos da PD. A proteína LRRK2 é uma ampla e complexa proteína com diversos domínios exibindo duas principais actividades enzimáticas, GTPase e cinase. A mutação mais conhecida, G2019S, leva ao aumento da actividade cinase...

O receptor para Angiotensina II tipo 1 (AT1R) é expresso tanto em membrana apical quanto basolateral dos túbulos proximais renais. Embora haja evidências de diferenças funcionais entre receptores apicais e basolaterais, como, por exemplo, a dependência do processo de internalização de receptores apicais, mas não de basolaterais, para a efetivação dos efeitos fisiológicos da Angiotensina II, os mecanismos envolvidos na determinação dessas diferenças não são conhecidos. Alguns trabalhos já evidenciaram a importância da porção c-terminal do receptor AT1 na sua internalização. Desta forma, com o intuito de identificar proteínas de membrana que possam interagir com tal região, foi feita a clonagem do fragmento de DNA correspondente a esta no vetor pGEX-6P-2. O produto da transcrição e tradução do gene foi uma proteína de fusão (GST-AT1aR) que possui em torno de 35kDa, a qual foi imobilizada em resina de glutationa sefarose e incubada com proteínas de membranas totais de córtex renal de ratos (GST pull-down assay). As amostras foram submetidas à Eletroforese Bidimensional, onde identificamos seis spots correspondentes a proteínas que interagem especificamente com a proteína de fusão, mas não com GST. Estes spots foram recortados e analisados por espectrometria de massa. Cinco diferentes proteínas foram identificadas como provavelmente associadas ao receptor AT1aR: ATP sintase subunidade beta...

O resveratrol, um polifenol de origem natural, é descrito como uma substância antiinflamatória, antioxidante, cardioprotetora e anticancerígena. Diversos estudos comprovam a atividade imunomodulatória do resveratrol in vitro e in vivo, estimulando ou diminuindo a secreção de citocinas envolvidas na resposta Th1/Th2. Além do uso em vacinas como adjuvantes, a descoberta de novas substâncias imunomodulatórias pode ser aplicada na profilaxia e tratamento de doenças imunodegenerativas com perda da tolerância sistêmica ou periférica. O objetivo desse estudo é relacionar o efeito modulador do resveratrol em ensaios de endocitose em macrófagos e de secreção de citocinas IL-6(produção de IgA) e IL-10(resposta Th2 e tolerância em mucosas) com a produção de anticorpos anti-ova IgG e IgA após imunização via-oral. Os resultados obtidos demonstraram que in vitro, houve aumento da endocitose em macrófagos e diminuição na secreção de IL-6 pelas células isoladas de placas de peyer em concentrações abaixo de 50 µM de resveratrol. Após a administração oral de resveratrol de 5 mg e 10 mg/kg observou-se o aumento significativo da secreção de IL-10 em esplenócitos isolados de camundongos Balb/C. Nos grupos imunizados com 1 mg de ovalbumina/animal e resveratrol (5 mg e 10 mg/kg) via oral 2 vezes...

Evidências epidemiológicas indicam que a presença de microalbuminúria prediz maior freqüência de eventos cardiovasculares e mortalidade em hipertensos essenciais. A microalbuminúria pode ser decorrente do aumento da permeabilidade glomerular e/ou da diminuição da reabsorção desta macromolécula no túbulo proximal. Todavia não é sabido se os mecanismos que regulam a reabsorção de albumina em túbulo proximal renal encontram-se alterados na hipertensão essencial. Este trabalho teve como objetivo investigar as bases moleculares da microalbuminúria associada à hipertensão arterial essencial, focando na reabsorção tubular de albumina. Para tanto, avaliamos a evolução temporal da excreção urinária de albumina em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) com 6 semanas de idade (pressão arterial sistólica, PAS, = 105 ± 4 mmHg), 14 semanas de idade (PAS = 180 ± 2 mmHg) e 21 semanas de idade (PAS = 202 ± 2 mmHg). Ratos normotensos Wistar da mesma idade serviram de controle. Observou-se que a excreção urinária diária de albumina aumentou progressivamente com o aumento da pressão arterial em SHR (10,5 ± 1,9; 92 ± 7,0 e 154 ± 27 g/dia, em SHR com PAS média igual a 105, 180 e 202 mmHg respectivamente). Este aumento progressivo não foi observado em ratos normotensos com idade correspondente...

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP); Folículos pré-antrais de 41 vacas da raça Nelore foram quantitativa e ultraestruturalmente descritos neste estudo. Uma média de 35.539,20 folículos pré-antrais foram isolados mecanicamente (Tissue Chopper) por animal. Os folículos foram processados para microscopia eletrônica de transmissão. Os folículos primordiais apresentaram um oócito rodeado por uma camada de células granulosas (CGs) achatadas, com algumas tendendo à forma cuboidal. As demais fases de desenvolvimento foram classificadas como folículos primários, com uma camada de CGs cuboidais, e secundários, com mais de duas camadas de CGs cuboidais. Os folículos primordiais apresentaram oócito evidente, com núcleo excêntrico e nucléolo bem definido, cercado por regiões de cromatina condensada. As organelas ao redor do núcleo eram, predominantemente, mitocôndrias arredondadas. Folículos em desenvolvimento apresentavam organelas mais dispersas e numerosas, com mitocôndrias alongadas. As comunicações entre o oócito e as CGs mantinham-se por zonas de aderência, coated pits e vesículas de endocitose. A zona pelúcida (ZP) começava a aparecer em folículos primários, mostrando microvilos pequenos e vesículas penetrando na ZP. Os folículos secundários apresentavam aglomerados de grânulos corticais em associação a complexos de Golgi. Concluímos que o método mecânico de isolamento fornece quantidades suficientes de folículos pré-antrais de ovários de vacas da raça Nelore e...

A região epididimária do pombo doméstico compreende a parte principal da rede testicular, os dúctulos eferentes do testículo e o ducto epididimário. Os canais epiteliais da rede testicular são contínuos com o segmento extratesticular da rede, o qual, por sua vez, é seqüente com os dúctulos eferentes proximais e distais e, finalmente, o ducto epididimário se forma em continuidade aos eferentes distais. O epitélio de revestimento deste sistema tubular extratesticular é cúbico simples na rede testicular e pseudo-estratificado colunar nos outros ductos da região epididimária, com células ciliadas e não-ciliadas presentes principalmente nos dúctulos eferentes. As características ultra-estruturais das células epiteliais dos túbulos da região epididimária do pombo, com base comparativa, permitiram inferir que a reabsorção de fluido seminífero parece ser a função principal dessas células, embora outros papéis citofisiológicos foram também propostos, tais como: endocitose adsorptiva, ciliogênese, e possivelmente secreção apócrina nas células não-ciliadas escuras.; The epididymal region of the domestic pigeon comprises the main part of the rete testis, the efferent ductules of the testis and the ductus epididymidis. The channels of the rete testis albuginic segment are continuous with the extratesticular rete testis segment. This part is sequent to the proximal and distal efferent ductules...

O sistema ubiquitina-proteossomo degrada proteínas marcadas com etiquetas de Ub. A ubiquitinação é um processo reversível e moléculas de Ub podem ser desconjugadas pelas enzimas desubiquitinantes (DUBs), que evitam a degradação e aumentam a meia vida de seus substratos. A DUB USP2a foi identificada na próstata humana, é regulada por andrógenos e tem sua expressão aumentada em adenocarcinomas. USP2a protege a enzima ácido graxo sintase (FAS) da degradação, a qual é superexpressa em vários tipos de tumores, inclusive nos carcinomas espinocelulares (CECs) bucais. O objetivo deste trabalho foi estudar a expressão desta DUB e seu papel biológico em células derivadas de CECs bucais humanos. Foram detectados RNAs mensageiros para USP2a nas quatro linhagens celulares estudadas, principalmente nas linhagens SCC-4 e -15. Os níveis protéicos de USP2a foram semelhantes nas quatro linhagens, sendo ligeiramente maiores na SCC-9 e -25. Portanto, não foi encontrada uma correlação entre a quantidade de RNAs mensageiros e dos produtos protéicos de USP2a. Através de experimentos de imunofluorescência, demonstramos USP2a no citoplasma das células SCC-9, havendo uma concentração na região perinuclear em algumas células. A expressão forçada de USP2a nas células SCC- 9 não conferiu vantagem proliferativa...

Streptococcus mutans é o principal patógeno da cárie dentária. Antígenos (Ags) secretados ou associados à superfície celular de S. mutans participam deste processo e incluem a proteína ligante de glucano B (GbpB), a qual pode influenciar na susceptibilidade à infecção por S. mutans. Estudos recentes indicam que a expressão de antígenos de superfície reconhecida por fagócitos é controlada por sistemas de dois componentes (SDC) em espécies relacionadas a S. mutans. O objetivo deste projeto foi investigar o efeito de variações na produção de GbpB e a influência de dois SDC, Cov (de control of virulence) e Vic (de virulence control), no padrão de internalização de S.mutans por macrófagos de camundongos. Foram avaliadas 10 cepas clínicas distintas previamente caracterizadas quanto ao padrão de síntese de GbpB e quatro mutantes knock-out de dois SDC: dois mutantes covR- e dois mutantes vicH-. Para isto, macrófagos murinos da linhagem Balb/c foram cultivados em meio RPMI e expostos a diferentes cepas de S. mutans. Os níveis de internalização bacteriana por macrófagos foram determinados através da contagem de macrófagos com bactérias internalizadas, com auxílio de microscópio óptico. Os mecanismos de internalização foram caracterizados em ensaios semelhantes com macrófagos previamente tratados com inibidores específicos dos processos de fagocitose...

A nanomedicina se tornou uma promessa de profundos impactos para a saúde humana através da utilização de nanopartículas, nanorobôs e outros nanomateriais para prevenir, diagnosticar ou curar doenças. Um dos exemplos de nanomateriais empregados na medicina são as nanopartículas de prata, que podem ser adquiridas por métodos químicos ou biossintéticos. As nanopartículas de prata apresentam alta atividade antimicrobiana, propriedade essa de grande interesse científico-industrial. Em vista disso, cresce também a preocupação em relação ao uso, manipulação e eliminação desse nanomaterial, visando uma aplicação mais segura. Diante dessas informações, o presente trabalho teve como objetivo investigar mecanismos moleculares envolvidos na citotoxicidade e processamento das nanopartículas biossintéticas de prata em macrófagos peritoneais obtidos de camundongos C57BL/6. Inicialmemte, demonstrando que as nanopartículas atingiram o IC50 de 25 µM em 6h de tratamento por redução do MTT. A análise de microscopia de fluorescência revelou alterações na integridade de membrana a partir de 3 h, que foram agravadas após 6 h de tratamento. Esse mesmo perfil foi observado por microscopia eletrônica de varredura, no qual revelou que após 3 h de tratamento as células já apresentavam perda de projeções celulares...

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2013; Os animais pertencentes à subfamília Bruchinae são os principais predadores das sementes de leguminosas, destacando-se pela restrição na dieta alimentar ocorrendo especificidade ao nível de gênero ou família. O caruncho do feijão-de-corda (Callosobruchus maculatus) é o maior predador de sementes de Vigna unguiculata (feijão-de-corda) tanto no campo quanto de grãos armazenados. O feijão-de-corda apresenta em sua composição uma família de proteínas multifuncionais chamadas de vicilinas (globulina 7S), possuindo uma massa molecular de aproximadamente 190 kDa. Vicilinas variantes expressas em sementes de V. unguiculata vem sendo associadas diretamente aos efeitos tóxicos causados nas larvas dos bruchideos. Aqui relata-se o valor adaptativo envolvido na absorção das vicilinas e o mecanismo da resistência associado ao C. maculatus. O genótipo (IT81D-1053) de V. unguiculata mostrou-se resistente ao bruchideo (C. maculatus), não havendo emergência de adultos no período de 90 dias, enquanto sementes suscetíveis (fradinho) apresentaram emergência média de 36...

A endocitose é um evento biológico já bem descrito em formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi, onde macromoléculas são internalizadas através da bolsa flagelar e/ou do complexo citóstoma/citofaringe e direcionadas aos reservossomos. Reservossomos são grandes organel estocam moléculas ingeridas e cruzipaína. O objetivo desta dissertação foi produzir anticorpos policlonais ou monoclonais (mAbs) contra proteínas identificada (cruzipaína e TcHIP), e utilizá estudos de endocitose em formas amastigotas de foram expressas em E. coli reatividade dos anti-soros foi confirmada por cruzi e contra proteína recombinante. Imunolocalização utilizando anticorpos policlonais anti-TcHIP mostrou que esta proteína está presente no complexo de Golgi em T. cruzi, o que foi confirmado por co anticorpos policlonais obtidos contra cruzipaína recombinante demonstraram esta proteína no Golgi e em reserv mAbs, esplenócitos de um camundongo imunizado com cruzipaína recombinante foram fusionados com células de mieloma da linhagem P3X63Ag8.653 (ATCC CRL Os hibridomas foram triados p hibridoma mais estável foi cruzipaína recombinante (mAb CZP Este anticorpo foi utilizado como ferramenta pa transferrina ingerida com a cruzipaína em formas amastigotas. Foi também possível demonstrar pela primeira vez por citometria de fluxo a atividade endocítica em formas amastigotas de T. cruzi. Trypanosoma cruzi...

A importância da cultura do camarão peneídeo Penaeus japonicus, bem como a existência no sul de Portugal da espécie autóctone P. kerathurus justificam o aprofundamento dos conhecimentos sobre o seu ciclo reprodutivo. O presente trabalho resulta de uma abordagem morfológica e endocrinológica da reprodução nestas espécies, através do estudo das alterações morfológicas do ovário e da ultrastrutura do ovócito bem como da sua relação com os níveis de hormonas ecdisteróides e esteróides sexuais durante a ovogénese.O estudo histológico do ovário de P. japonicus e P. kerathurus permitiu definir cinco fases vitelogénicas: Fase I Previtelogénese. Fase II - Previtelogénese avançada ou vitelogénese primária. Fase III - Vitelogénese (vitelogénese secundária). Fase IV - Maturação (formação de vesículas corticais). Fase V Desova. O presente trabalho constitui o primeiro estudo ultrastrutural da vitelogénese na espécie P. kerathurus, demonstrando pela primeira vez nos peneídeos, a formação do retículo endoplásmico e a origem dos grânulos densos. A origem dos vacúolos autofágicos e a presença simultânea de dois tipos de células foliculares nos crustáceos, bem como a presença de pontes intercelulares ("nurse-cells") na sub-classe malacostraca...

Tese de doutoramento em Ciência e Tecnologia de Materiais (ramo de conhecimento em Engenharia de Tecidos - Materiais Híbridos); In the recent years, great progress has been done in the emerging field of tissue engineering. Despite the important advances the performance of cells-scaffold constructs, one of the several tissue engineering approaches, remains limited in part due to the need for optimize cell culture techniques and culture media. Nanocarrier systems have generated a significant amount of interest in the ex vivo cell maintenance, and control of the cellular fate in vivo mainly due to their internalization efficiency, drug loading capacity, and to favorably modulate the solubility and pharmacokinetics of drugs. Dendrimers are synthetic, monodispersive, spherical and highly branched macromolecules that present unique advantages and fulfills most requirements as carriers for drug delivery; however, it has been found that high generation dendrimers are often cytotoxic. Thus, in this thesis we focused our attention in this fundamental problem and explore the development of novel nanobiomaterials based on the grafting of carboxymethylchitosan (CMCht) onto low generation poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers, the socalled CMCht/PAMAM dendrimer nanoparticles. These macromolecular vehicles were developed to explore a new concept consisting on the intracellular and controlled delivery of bioactive molecules aimed at control stem cells functions in a more effective manner ex vivo...

A Doença de Alzheimer (DA) é uma doença multifactorial e progressiva do sistema nervoso central. Apresenta uma incidência mundial de 2-7% em indivíduos com mais de 65 anos e de cerca de 50% em indivíduos acima dos 85 anos de idade. As principais alterações histopatológicas observadas nos doentes são a presença de tranças neurofibrilhares intracelulares e depósitos extracelulares de um peptídeo de 4 KDa denominado Abeta, que é o principal componente das placas de amilóide. Apesar da sua etiologia multifactorial, há uma correlação bem descrita entre esta patologia e o Abeta (peptídeo neurotóxico). O Abeta deriva fisiológica e proteoliticamente de uma glicoproteína transmembranar com características de receptor: a Proteína Percursora de Amilóide de Alzheimer (PPA). As possíveis funções fisiológicas da proteína PPA, o seu destino e vias de processamento celulares, conjuntamente com possíveis proteínas celulares que com ela interajam, são assim tópicos de interesse e áreas de investigação científica mundial. A PPA possui na sua estrutura primária sequências consenso para fosforilação, quer no seu ectodomínio quer no seu domínio intracelular, já descritas como sofrendo fosforilação “in vitro” e “in vivo”. Mais ainda...

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010; Epithelial integrity generally depends on the balance between the stability and remodelling of adherens junctions (AJs). Growing evidence indicates that endocytosis has a central role in maintaining AJs in a state of dynamic equilibrium. However, it is not currently understood how AJs remodelling is achieved without losing epithelial integrity. In this work, I found that Capping Protein (CP), which prevents extension of the barbed ends of actin filaments, interacts genetically with atypical protein kinase C (aPKC), a major effector of the Par-aPKC complex, to maintain epithelial integrity in Drosophila wing imaginal disc. This genetic interaction appears to have differential requirements along the wing disc, since decreasing CP and aPKC levels induce extrusion and death of wing blade cells, whereas cells in the distal hinge region seem to overproliferate. Interestingly, loss of CP results in a significant reduction of aPKC from the apical membrane, suggesting that CP may restrict apical localization of aPKC, which in turn, is required to control AJs dynamics. In addition, similar to apkc mutant tissues, loss of CP leads to decreased apical levels of the AJs components...

Tese de doutoramento, Bioquímica (Genética Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011; Cystic Fibrosis (CF) is a genetic disease leading to a progressive major pulmonary dysfunction and caused by mutations in the gene encoding the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) protein, which, in CF, has impaired function and/or expression. CFTR is an ABC-transporter expressed at the apical membrane of epithelial cells where it functions as a cAMP-dependent, PKA-regulated Cl- channel. In turn, CFTR also regulates other ion conductances such as the epithelial Na+ channel (ENaC) which is inhibited by CFTR. This leads to a major characteristic of CF epithelia, i.e., defective CFTR-mediated Cl- secretion and enhanced Na+ absorption. Traditional CF therapies treat the symptoms. However, several different therapeutic approaches for the treatment of the basic defect in CF are being pursued. In addition to “CFTR-assist” strategies aiming at correct the intrinsic defect of multiple CFTR mutations, others such as inhibition of ENaC and/or activation of alternative Clchannels, e.g. Ca2+-activated Cl- channels (CaCCs) may be able to partially by-pass and overcome the defects caused by the loss of CFTR. The feasibility of these non- CFTR based approaches requires a better knowledge of the characteristics and regulation of the ion channels in question...

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2011; Gamma-aminobutyric acid (GABA) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the central nervous system. Its activity at the synapse is terminated by re-uptake into nerve terminals and astrocytes, through membrane located specific GABA transporters (GATs), which therefore shape GABAergic transmission. There are three main high affinity subtypes of GATs, GAT-1, GAT-2 and GAT-3, and a low affinity one, the betaine transporter. GAT-1 is the predominant GABA transporter in the brain and is expressed in neurons and astrocytes. Several factors can regulate the continuous traffic of GATs to and from the neuronal plasma membrane. For instance surface expression of GAT-1 in cultured neurons and isolated nerve terminals is decreased by protein kinase C (PKC)-dependent phosphorylation. In contrast, surface expression of GAT-1 in neurons is enhanced by brain derived neurotrophic factor (BDNF)-mediated tyrosine kinase-dependent phosphorylation. Though reuptake of GABA might occur at different places of the neuronal membrane, its reuptake by the nerve terminal is the process that allows quick refilling of the released stores. On the other hand...

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013; O RNA de interferência (RNAi) é um mecanismo de silenciamento genético desencadeado por estruturas de RNA de cadeia dupla (dsRNA). Este mecanismo apresenta uma importante função antiviral e, devido à sua elevada especificidade, capacidade de silenciamento e potencial efeito sistémico, tem-se demonstrado uma eficaz ferramenta de indução de perda-de-função em investigação. Além disso, este mecanismo tem sido proposto como potencial pesticida para o controlo de pragas agrícolas. A resposta RNAi é muito variável, quer entre espécies, quer dentro da mesma espécie, podendo variar consoante o tecido, estado de desenvolvimento e método de entrega do dsRNA. Contudo, os mecanismos envolvidos têm sido essencialmente estudados em Drosophila melanogaster, que possui uma sensibilidade baixa ao RNAi (sistémico). Por outro lado, o gafanhoto do deserto, Schistocerca gregaria, demonstra uma resposta RNAi de elevada robustez e sensibilidade. Neste contexto, uma vez que esta espécie constitui uma praga voraz e que o RNAi pode contribuir para estratégias seletivas de controlo de pragas agrícolas, o gafanhoto do deserto constitui um organismo muito interessante para a investigação dos mecanismos do RNAi (sistémico). Em S. gregaria...

Resumo: Entender a via endocítica de protozoários parasitas da família Trypanosomatidae (Euglenozoa: Kinetoplastea) é fundamental, pois esta via desempenha um importante papel no direcionamento intracelular de nutrientes e de agentes terapêuticos. Esta dissertação teve por objetivo avaliar a participação da clatrina nos eventos iniciais de endocitose em Trypanosoma cruzi, bem como sua localização ub-celular. Assim, identificamos no genoma de T. cruzi os genes que codificam a cadeia pesada de clatrina (Tc00.1047053506167.50 - TcClatrina), a cadeia leve de clatrina (Tc00.1047053506211.240 - TcCLC), para a subunidade do complexo adaptador AP (Tc00.1047053506247.200 - APb). Foram produzidos anticorpos policlonais em camundongo para cada uma dessas quatro proteínas. Análise por Western blot demonstrou que os antisoros para TcClatrina e APb reagiram com polipeptídios de peso molecular previsto em diferentes tripanosomatideos. Usando o anticorpo para TcClatrina observamos por microscopia confocal a localização desta proteína na bolsa flagelar de formas epimastigotas e na região compatível com o Complexo de Golgi e formas tripomastigotas de T. cruzi. Além disso, também houve reação positiva ifusa pelo citoplasma das células...

This work investigated the subcellular dynamics of the plant elicitor peptide AtPep1 and its interplay with plant defense responses. First, an introduction of the plant innate immunity system is provided with emphasis on pattern trigger immunity (PTI), which is based on the recognition of "non-self" and "self" elicitor molecules by surface-localized patternrecognition receptors (PRRs). Then, the Arabidopsis endogenous peptides that act as selfelicitor molecules are presented, with details on AtPep1 and its PEPR receptors. Plant endomembrane trafficking is described, encompassing endocytic pathways, clathrin mediated endocytosis (CME) and receptor-mediated endocytosis (RME). In the next chapter, we explored strategies for the in vivo study of the subcellular behavior of AtPep1; to this end, we fused the precursor protein of AtPep1 (PROPEP1) to GFP and assessed its localization. We found that PROPEP1 was associated with the tonoplast and accumulated in the vacuole, suggesting that this organelle could work as the station where PROPEP1 is stored and later released, only in a danger situation, hence initiating AtPep1. Moreover, we generated AtPep1 versions labeled with fluorescent dyes and demonstrated that this peptide could be fluorescently tagged without loss of its biological activity. In chapter 3...