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Estudos por modelagem e dinâmica molecular integradas a técnicas físicas para biomoléculas em solução - interação de receptores nucleares a elementos responsivos no DNA e dinâmica inter-domínios da celobiohidrolase I; Integrated experimental biophysics and molecular dynamics simulations of biomolecules in solution - the interaction of nuclear receptors with DNA response elements and the inter-domain dynamics of Cellobiohydrolase I

Lima, Leonardo Henrique França de
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Tese de Doutorado Formato: application/pdf
Publicado em 26/09/2011 PT
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Movimentos coletivos prestam um papel fundamental na dinâmica e energética de biomoléculas em solução. Estes movimentos permitem o acoplamento de regiões significativamente distantes, apresentando considerável influência, por exemplo, no alosterismo para a formação de complexos macromoleculares e no funcionamento integrado de proteínas multidomínios como "máquinas moleculares". Neste trabalho de doutoramento, serão apresentados os resultados referentes à aplicação conjunta de técnicas experimentais biofísicas, de modelagem estrutural e de dinâmica molecular no estudo de dois sistemas para os quais estes movimentos coletivos demonstram considerável importância funcional. Para a interação do receptor nuclear do ácido 9-cis-retinóico com seu elemento responsivo específico no DNA (HRE), a comparação de estudos de dinâmica molecular com ensaios de afinidade por anisotropia de fluorescência sugere que a resistência inicial para a associação do monômero, seguida da acentuada colaboratividade na associação do dímero é regida por um impedimento da associação do domínio de ligação ao DNA (DBD) para o primeiro à sequência responsiva devido, em última análise, a uma não complementaridade dos modos coletivos mútuos. Este impedimento para a associação monomérica inicial é mais acentuado para o monômero 5' (para o qual a menor especificidade de ligação à seqüência específica já é bem documentada)...

Produção e caracterização de proteínas do complexo celulolítico de Trichoderma harzianum, envolvidas na hidrólise enzimática da biomassa; Production and Characterization of proteins from the cellulolytic cocktail of Trichoderma harzianum, involved in enzymatic hydrolysis of biomass

Serpa, Viviane Isabel
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Tese de Doutorado Formato: application/pdf
Publicado em 02/05/2012 PT
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26.23%
Celulases têm atraído muito interesse nos últimos anos devido a sua habilidade na bioconversão de material lignocelulolítico em glucose, a qual pode, então, ser convertida a etanol por fermentação. O complexo celulolítico capaz de degradar a celulose consiste de várias enzimas (principalmente celulases e β-glucosidases) e proteínas auxiliadoras, que atuam em sinergismo para eficientemente hidrolizar a biomassa. Nesse estudo, investigou-se a hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado utilizando enzimas produzidas por T. harzianum e enzima comerial. O rendimento de hidrólise foi avaliado quanto a diferentes níveis de deslignificação de biomassa, graus de cristalinidade da celulose, composição dos coquetéis enzimáticos e adição de BSA. Estudos de difração de raios-X mostraram que a cristalinidade da lignocelulose não é um fator determinante na recalcitrância ao ataque enzimático. Além disso, a adição de BSA não teve qualquer efeito no rendimento da hidrólise. O mais eficiente coquetel enzimático foi obtido misturando o preparado comercial com o produzido pelo T. harzianum (rendimento acima de 97%). Esse desempenho está, provavelmente, relacionado com níveis adequados de β-glucosidases e xilanases no coquetel. Devido a essa eficiente atividade celulolítica...

Caracterização bioquímica, biofísica e estrutural da Celobiohidrolase I de Trichoderma harzianum envolvida na hidrólise da biomassa lignocelulósica; Biochemistry, biophysics and structural characterization of cellobiohydrolase I from Trichoderma harzianum involved in the hydrolysis of lignocellulosic biomass

Colussi, Francieli
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Tese de Doutorado Formato: application/pdf
Publicado em 01/10/2012 PT
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Devido à sua importante atividade celulolítica, o fungo Trichoderma harzianum possui um grande potencial de aplicação na hidrólise da biomassa. No entanto, as celulases deste fungo filamentoso ainda não foram caracterizadas em profundidade. A celobiohidrolase I (CBHI) é a principal enzima celulolítica produzida por Trichoderma sp. e atualmente é uma das celulases mais investigadas para aplicações de biocombustíveis. A CBHI hidrolisa celulose cristalina à unidades solúveis de celobiose, o que a torna uma enzima chave para a produção de açúcares fermentáveis a partir da biomassa. O objetivo deste trabalho foi purificar e caracterizar a CBHI de Trichoderma harzianum (ThCBHI) bioquímica, biofísica e estruturalmente. Primeiramente foi estabelecido um protocolo de purificação eficiente da proteína a partir da expressão homóloga no fungo. A caracterização bioquímica ThCBHI mostrou que a proteína possui uma massa molecular de 66 kDa, pI de 5,23 e o pH e a temperatura de atividade ótima foram 5,0 e 50 ºC, respectivamente. A influência do pH e temperatura sobre as estruturas secundárias e terciárias e atividade enzimática da ThCBHI foram analisados por espectroscopia de CD, fluorescência e SAXS, e os resultados mostraram que as perturbações de pH e de temperatura afetam a estabilidade por dois mecanismos diferentes. As variações de pH podem modificar a protonação dos resíduos...

Estudo de pré-tratamentos da biomassa e da interação enzimática por meio de técnicas espectroscópicas e de microscopia óptica de alta resolução; Study of pretreatments of biomass and enzymatic interaction by spectroscopic techniques and high resolution optical microscopy

Coletta, Vitor Carlos
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Dissertação de Mestrado Formato: application/pdf
Publicado em 06/02/2013 PT
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16.23%
Neste trabalho, foram utilizadas metodologias ópticas para estudo da interação enzimática e de pré-tratamentos da biomassa. Mudanças de carga em fibras de polpa de eucalipto foram estudadas utilizando-se uma porfirina como sonda, uma vez que influenciam na interação enzimática. Foi investigada também a influência do caráter de carga na interação com a safranina, utilizada como marcador de celulose. Estudamos o efeito do pH na interação da enzima Celobiohidrolase Cel7A (CBH I) e de seus domínios separadamente com as fibras de eucalipto por meio do método de arraste, que se baseia na centrifugação da solução dos interagentes e na análise espectroscópica do sobrenadante. Essa interação também foi estudada por microscopia de fluorescência confocal utilizando-se fluoresceína como marcador para as enzimas. Outro objetivo do trabalho foi aplicar a microscopia confocal e a microscopia de imagem de tempo de vida da fluorescência (FLIM),com excitação por um e por dois fótons, para estudar a atuação de um pré-tratamento em bagaço de cana-de-açúcar. Esse pré-tratamento teve duas etapas: a primeira com ácido e a segunda com base.Os resultados para a interação da CBH I com as fibras de eucalipto mostram que esta é influenciada por mudanças de carga tanto no módulo de ligação à celulose (CBM) quanto no domínio catalítico. Imagens espectrais de microscopia confocal indicam a presença da enzima em interstícios ao longo de toda a parede da fibra. Nas amostras de bagaço...

Investigação da interação enzimática e das suas mudanças estruturais durante a hidrólise da biomassa lignocelulósica através de metodologias óticas; Investigation of the enzymatic interaction and its structural changes during lignocellulosic biomass hydrolysis by using optics methodologies.

Conceição, Fernando Rodrigues da
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Dissertação de Mestrado Formato: application/pdf
Publicado em 03/08/2012 PT
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26.17%
A investigação do processo de interação da enzima responsável pela hidrólise da biomassa lignocelulósica e das suas alterações estruturais são de suma importância no que diz respeito à otimização da produção do etanol de segunda geração proveniente da biomassa lignocelulósica. Neste contexto, metodologias óticas foram desenvolvidas e empregadas no presente trabalho na caracterização da interação enzimática com substrato celulósico. Basicamente, foram utilizadas espectroscopia de absorção Uv/vis, fluorescência e dicroísmo circular (CD). Fibras de eucalipto e celulose microcristalina (Avicel) foram usadas como substrato. Com o auxílio da fluorescência intrínseca da enzima Celobiohidrolase I de Thrichoderma harzianum (ThCBHI), foi possível desenvolver o método de arraste enzimático que nos permitiu determinar a dependência da interação enzima-substrato com o pH e a temperatura e estimar o número de enzimas adsorvidas na biomassa lignocelulósica. O efeito destes parâmetros sobre as estruturas secundárias da enzima ThCBHI e de sua influencia na interação enzimática também foi estudado. Medidas da seção choque efetiva de absorção demonstraram que a estrutura da ThCBHI sofreu grande influencia do pH e da temperatura...

Regulação transcricional por glicose do promotor do gene que codifica celobiohidrolase I de Trichoderma reesei em Saccharomyces cerevisiae; Transcriptional regulation by glucose of the promoter of the gene encoding cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei in Saccharomyces cerevisiae

Pereira, Dirce Maria Carraro
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Tese de Doutorado Formato: application/pdf
Publicado em 11/05/1998 PT
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O sistema celulolítico do fungo filamentoso Trichoderma reesei é induzido transcricionalmente em pelo menos 1000 vezes pelo crescimento do fungo na presença de celulose e fortemente reprimido por glicose. Usando a abordagem de deleção no promotor, determinou-se que a região localizada entre -241 e -72 bp, em relação ao TATA box, denominada UARcb1, é responsável pela transcrição estimulada por celulose da enzima celobiohidrolase I (cbhl). Neste trabalho mostramos que essa região controla a transcrição de um gene repórter, sofrendo repressão por glicose, em Saccharomyces cerevisiae, um microrganismo que não possui os genes necessários para a utilização de celulose. A transcrição mediada por UARcbl, que é controlada por glicose, requer o produto do gene SNFl, uma proteína quinase, e dois repressores: SSN6 e TUP1, cujos papéis no controle de genes reprimidos por glicose, na levedura, são bem estabelecidos. Nossos resultados indicam um mecanismo conservado de controle por glicose em microrganismos eucarióticos.; The cellulotic system of the filamentous fungus Trichoderma reesei is transcriptionally induced 1000 -fold in presence of cellulose and is strongly repressed by glucose. Using the promoter deletion approach...

Detecção e caracterização de complexos multi-enzimáticos em secretoma de fungos filamentosos

Silva, Adelson Joel da
Fonte: Universidade de Brasília Publicador: Universidade de Brasília
Tipo: Tese
POR
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26.83%
Tese (doutorado)— Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012.; As enzimas que degradam parede celular vegetal produzidas por micro-organismos possuem aplicações biotecnológicas importantes, incluindo a produção de bioetanol. Algumas batérias anaeróbicas são capazes de produzir complexos multi-enzimáticos chamados de celulosomos, enquanto os fungos filamentosos normalmente secretam enzimas hidrolíticas individuais que atuam sinergisticamente no processo de degradação de polissacarídeo. Neste trabalho, nós mostramos que os fungos filamentosos Trichoderma harzianum e Trichoderma reesei, secretam complexos multi-enzimáticos ativos quando cultivados em meio contendo o resíduo agrícula bagaço de cana-de-açucar e lactose (ou galactose), respectivamente. O secretoma de ambos os fungos foram analisadas primeiramente por 1D-BN (blue native)-PAGE. Bandas eletroforéticas correspondendo a possíveis complexos foram submetidas à separação eletroforética usando sistema Tricina-SDS-PAGE para demonstrar que são constituídas de componentes menores. Ensaios zimográficos foram realizados usando 1D-BN-PAGE e 2D-BN/BN-PAGE para verificar atividades celulolítica e xilanolítica em um mesmo complexo. Finalmente...

Enzymatic treatment of acrylic and cellulose acetate fibres

Matamá, Maria Teresa
Fonte: Universidade do Minho Publicador: Universidade do Minho
Tipo: Tese de Doutorado
Publicado em 14/11/2008 ENG
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Thesis for Doctoral (degree in Textile Engineering Textile Chemistry); The background theme of the present thesis is the multidisciplinary area of textile biotechnology, which is of major importance for the textile industry and its sustainable development. The work here described was devoted to the treatment with enzymes of two manmade fibres - acrylic and cellulose acetate. The thesis is divided in several chapters being the first one a general introduction. Biocatalysis is addressed, especially in the context of textile industry and surface modification of polymers, followed by a general description on the properties and applications of both fibres. The enzymes used throughout the work – nitrilase (EC 3.5.5.1) and cutinase (EC 3.1.1.74), are briefly mentioned as well as the major methods to manipulate and improve enzymes. The general aim of the work is the formation of reactive and/or hydrophilic groups at the surface of acrylic and cellulose acetate fibres by enzymatic hydrolysis of their pendent groups. As follows, the purpose is to preserve the desirable bulk properties of the fibres acting only at the surface by using eco-friendly catalysts. In chapter 2, the modification of the surface of acrylic fabric with a commercial nitrilase is reported. The enzymatic conversion of nitrile groups into the carboxylic groups...

Production of cellulose-binding domains by proteolysis : studies on the adsorption and modification of cellulose fibres

Pinto, João Ricardo
Fonte: Universidade do Minho Publicador: Universidade do Minho
Tipo: Tese de Doutorado
Publicado em 29/01/2007 ENG
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Tese de Doutoramento em Engenharia Química e Biológica; Most cellulose degrading enzymes are composed of modular structures. In the case of fungi, cellulases are formed by a catalytic domain (CD) and by a cellulose-binding domain (CBD), interconnected through a highly glycosylated protein linker. These enzymes are used for paper production, either to allow a more efficient refinement or to improve the paper sheet production. This work aimed at implementing a procedure to produce significant amounts of purified CDBs. The purified CBDs coating of the fibers surface was assessed by a method based on fluorescence microscopy. Finally, the application of CBDs in paper production was evaluated. The CBDs production was achieved by proteolysis, with papain, of the commercial preparation Celluclast® (cellulases from Trichoderma reesei). Afterwards, the CBDs were separated by ultrafiltration and further purified by ion exchange chromatography. The obtained CBDs is part of cellobiohydrolase I, as demonstrated by N-terminal peptide sequencing and MALDI-TOF. The isolated proteins kept the highly glycosylated peptide linker, as verified by sugar analysis, that demonstrated the existence of 30% (w/w) of carbohydrates, most of which mannose (85%). It was shown that these CBDs...

Physiological characterization of Ashbya gossypii and strain development for recombinant protein production; Caracterização fisiológica do fungo Ashbya gossypii e desenvolvimento de estirpes para produção de proteínas recombinantes

Ribeiro, Orquídea
Fonte: Universidade do Minho Publicador: Universidade do Minho
Tipo: Tese de Doutorado
Publicado em 28/09/2012 ENG
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Tese de doutoramento em Engenharia Quimica e Biológica; Ashbya gossypii is a phytopathogenic hemiascomycete belonging to the Saccharomycetaceae family. This fungus has attracted attention because of its natural ability to produce riboflavin (vitamin B2) as a detoxifying and protective mechanism being used at an industrial level as a biotechnological important producer of riboflavin. The genome sequence of this filamentous fungus revealed remarkable similarities to that of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae both at the level of homology and synteny. A. gossypii is a very promising experimental system because it has a small genome (the smallest eukaryotic genome known to date) and haploid nuclei. Moreover, efficient gene targeting due to the high homologous recombination efficiency in A. gossypii makes it possible to do one-step gene replacement by PCR-based gene targeting. A. gossypii also allows extrachromosomal free replication of plasmids bearing an autonomous replicator. Taking advantage of these unique features, the overhall purpose of this project was to explore the potential of A. gossypii as an alternative cell factory organism. As little information was available for this organism, the project began with the physiological characterization of different A. gossypii strains. Also...