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Interações de peroxirredoxinas citossólicas da levedura Saccharomyces cerevisiae com peróxidos. Estudos cinéticos e funcionais; Saccharomyces cerevisiae cytosolic peroxiredoxin interactions with peroxides. Kinetics and functional studies

Ogusucu, Renata
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Tese de Doutorado Formato: application/pdf
Publicado em 12/03/2009 PT
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56%
As peroxirredoxinas constituem uma família de tiol-proteínas, que reduzem peróxido de hidrogênio, peróxidos orgânicos e peroxinitrito a água, álcool e nitrito, respectivamente, utilizando equivalentes redutores fornecidos pela tiorredoxina, tiorredoxina redutase e NADPH. As peroxirredoxinas são enzimas abundantes (constituem aproximadamente 0,7 % do total de proteínas solúveis presentes em leveduras) e foram identificadas em diversas espécies de animais, plantas e bactérias, porém seu papel fisiológico ainda é discutido. Até recentemente, as peroxirredoxinas eram consideradas pouco eficientes para detoxificar peróxidos, em comparação às catalases e heme-peroxidases. De fato, as constantes de segunda ordem determinadas para as reações de peroxirredoxinas com peróxido de hidrogênio eram da ordem de 104-105 M-1 s-1, valores muito menores que os de hemeproteínas (~107 M-1 s-1). Neste trabalho, um método de cinética competitiva foi desenvolvido para re-determinar essas constantes de velocidade, utilizando a peroxidase de raiz forte como competidora das peroxirredoxinas de S. cerevisiae, Tsa1 e Tsa2. Este método foi validado e as constantes de velocidade determinadas para Tsa1 e Tsa2 foram da ordem de k~ 107 M-1 s-1 para a reação com peróxido de hidrogênio e da ordem de k~10105 M-1 s-1 para a reação com peroxinitrito. Utilizando a mesma metodologia...

Oxidação quimiluminescente de bases de Schiff catalisada por peroxidase: aspectos mecanísticos e toxicológicos; Chemiluminescent oxidation of Schiff bases catalyzed by peroxidase: mechanistic and toxicological aspects

Medeiros, Marisa Helena Gennari de
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Tese de Doutorado Formato: application/pdf
Publicado em 24/02/1986 PT
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66.25%
A enzima peroxidase (HRP) , agindo como uma oxigenase em substratos apropriados, promove a formação de espécies excitadas no estado triplete. Estes produtos excitados podem ser formados em sistemas bioquímicos e promover processos fotoquímicos no escuro. Nesta linha de estudos, investigamos a oxidação aeróbica, na presença de HRP, de substratos contendo ligações de Schiff. Esses compostos são de grande importância biológica, uma vez que participam como intermediários em diversas reações enzimáticas (transaminação, biossíntese de aminoácidos, biossíntese de profirinas), nas ligações cruzadas do colágeno e da elastina, na hemoglobina AlC, na rodopsina e bacterionodopsina e como produtos finais da lipoperoxidação. A oxidação aeróbica de quatro iminas alifáticas (BPA, i-BMA, sec-BMA e BVA) , catalisada por HRP, é quimiluminescente. A natureza triplete da espécie excitada foi sugerida pelo espectro de quimiluminescência, por meio de estudos de transferência de energia para DBAS e clorofila e pela supressão de quimiluminescência por oxigênio, sorbato, indol e p-benzoquinona. Com base nos altos valores de kETo encontrados, concluimos que a transferência de energia esteja ocorrendo provavelmente por um mecanismo a longa distância. A análise dos produtos da reação e os dados cinéticos indicam que a reação ocorre provavelmente segundo a via: (VER Esquema no arquivo) Ressalta-se que esta reação constitui um modelo mais adequado para sistemas bioluminescentes do que o proposto por McCapra e Burford (1976) com bases de Schiff aromáticas em t-butóxido e DMSO. Os sistemas aqui descritos também apresentam a possibilidade de desenvolvimento de método analítico...

Espécies excitadas tripletes em sistemas biológicos - visita à hipótese de "fotobioquímica no escuro" de Giuseppe Cilento; Triplet excited species in biological systems - a visit to the "photobiochemistry without light" hypothesis from G. Cilento

Mano, Camila Marinho
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Tese de Doutorado Formato: application/pdf
Publicado em 02/12/2013 PT
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45.89%
Espécies carbonílicas tripletes formadas quimicamente no escuro, por exemplo, durante a peroxidação de lipídios, têm reatividade química análoga à de radicais alcoxilas. Aventou-se que tais espécies possam estar implicadas na fisiopatologia de doenças degenerativas ("estresse carbonílico"). A pesquisa dos efeitos de espécies tripletes sobre algumas biomoléculas e consequentes respostas biológicas, propostas e pesquisadas no período 1970 - 1990 (hipótese de "fotoquímica sem luz" dos Profs. G. Cilento, IQUSP, e Emil H. White, Johns Hopkins University), encontrou empecilhos instrumentais e relativamente poucas propostas foram confirmadas. Com o uso de técnicas de alta resolução, tais como EPR, HPLC e MS, este trabalho teve como objetivo analisar intermediários e produtos de tais processos e estudar mecanismos de reação de acetona triplete, produzida quimicamente pela decomposição térmica de 3,3,4,4-tetrametildioxetano (TMD) ou, enzimaticamente, pela oxidação aeróbica de isobutanal (IBAL), catalisada por peroxidase de raiz forte (HRP), na presença de aminoácidos e proteínas. Este trabalho demonstra a formação de um radical acetila, presumidamente formado da clivagem α de acetona triplete, e um radical terciário centrado em carbono...

Adutos de DNA relacionados ao estresse oxidativo e glicação avançada em ratos diabéticos; DNA adducts related to oxidative stress and advanced glycation in diabetic rats.

Santos, Fabiana Almeida dos
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Dissertação de Mestrado Formato: application/pdf
Publicado em 17/10/2014 PT
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56.08%
O diabetes mellitus é considerado um dos problemas de saúde globalmente mais desafiadores do século 21. De acordo com as estimativas recentes do International Diabetes Federation - IDF, cerca de 382 milhões de pessoas são diabéticas e esse número tende a aumentar para além de 592 milhões em menos de 25 anos. Para melhor compreensão do Diabetes mellitus e suas complicações torna-se necessário buscar novos marcadores para a doença. O DM promove estresse oxidativo, inflamação e a formação de produtos avançados de glicação não enzimática (AGES), o que leva a dano tecidual no paciente diabético. Marcadores de dano oxidativo em proteínas e lipídeos na vigência do DM têm sido amplamente abordados na literatura, no entanto o estudo de lesões em DNA ainda requer mais atenção em modelos in vivo. Este trabalho teve como objetivo avaliar o dano oxidativo e resultante de glicação avançada em rim, fígado, cerebelo, sangue e urina de animais diabéticos, assim como a modulação do dano por diferentes períodos de tratamento com insulina, a fim de verificar se o controle da glicemia nos animais diabéticos protege contra a indução dos danos em biomoléculas. Para a indução do DM nos ratos Sprague-Dawley foram administrados 40 mg de STZ por kg de peso corpóreo por via intravenosa. Os níveis de MDA e 5-metildC foram avaliados por HPLC-DAD. A quantificação de HbA1c e dos adutos 1...

Avaliação da interação do hidroperóxido de urato com a proteína dissulfeto isomerase (PDI) em processos inflamatórios; Evaluation of the interaction of urate hydroperoxide with protein disulfide isomerase (PDI) in inflammatory processes

Patricio, Eliziane de Souza
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Dissertação de Mestrado Formato: application/pdf
Publicado em 11/07/2014 PT
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65.89%
A oxidação do ácido úrico (7,9-diidro-1H-purina-2,6,8(3H)-triona) pela mieloperoxidase (MPO) gera o radical de urato que, em presença do radical ânion superóxido combinam para formar o hidroperóxido de urato (HOOU). Considerando os altos níveis de MPO, ácido úrico e superóxido na placa de ateroma espera-se que o ácido úrico seja oxidado a HOOU neste microambiente inflamatório. O HOOU é um oxidante mais forte que o peróxido de hidrogênio e pode oxidar grupos tiólicos de proteínas como a proteína dissulfeto isomerase (PDI). Como consequência à oxidação da PDI, ocorre uma modulação positiva sobre a NADPH oxidase (Nox) com aumento da produção de superóxido por neutrófilos. Sendo assim, a formação do HOOU no leito vascular poderia elucidar os mecanismos moleculares pelos quais o urato colabora para a progressão da aterosclerose em pacientes com hiperuricemia. Para investigar a interação do HOOU com a PDI, padronizou-se a síntese química do HOOU através de um sistema de fotooxidação do tipo I, utilizando urato, riboflavina (fotossensibilizador) e luz UVA. Inicialmente padronizou-se o tipo de irradiação e tempo de reação com o melhor rendimento para a síntese do HOOU. O HOOU formado e seu produto de redução o álcool 5-hidroxiisourato foram separados...

Novo papel da proteína XPC na regulação dos complexos da cadeia de transporte de elétrons e desequilíbrio redox; New role of XPC protein in regulating the electron transport chain complexes and redox unbalance

Mori, Mateus Prates
Fonte: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP Publicador: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Tipo: Tese de Doutorado Formato: application/pdf
Publicado em 22/04/2015 PT
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55.89%
Espécies reativas de oxigênio (EROs) são normalmente e continuamente geradas em mitocôndrias, majoritariamente na cadeia de transporte de elétrons (CTE). Harman (1956, 1972 e 1992) teorizou que os radicais livres gerados nas mitocôndrias seriam a principal causa do envelhecimento. De fato, durante o envelhecimento é observado um desequilíbrio entre formação e remoção de EROs, que resulta em estresse redox. Essa condição favorece a formação de lesões oxidadas no DNA, acarretando em mutagênese ou morte celular. Diversos mecanismos moleculares cooperam para o reparo de DNA. Duas vias de reparo de DNA lidam com a maioria das lesões: o reparo por excisão de base (BER) e o reparo por excisão de nucleotídeos (NER). A via BER corrige pequenas modificações de bases que surgem de reações de desaminação, alquilação e oxidação. A via NER é mais versátil, reconhecendo lesões que distorcem a dupla hélice de DNA, como danos induzidos por luz UV e adutos volumos. Pacientes xeroderma pigmentoso (XP-A a XP-G) herdam mutações em um de sete genes que codificam proteínas envolvidas na via NER, ou em um gene que codifica uma polimerase translesão (XP-V). A doença é caracterizada por fotosensibilidade e incidência elevada de neoplasias cutâneas. A proteína XPC atua na etapa de reconhecimento da lesão de DNA na subvia de reparo global do genoma (GG-NER)...

O Mecanismo de ação da ecteinascidina-743 e sua interação com a reparação do DNA

Soares, Daniele Grazziotin
Fonte: Universidade Federal do Rio Grande do Sul Publicador: Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Tipo: Tese de Doutorado Formato: application/pdf
POR
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25.89%
A ecteinascidina-743 (ET-743) é um alcalóide marinho que tem apresentado potente atividade antitumoral contra uma variedade de tumores humanos, incluindo sarcomas, câncer de mama e de ovário. Em resposta aos resultados promissores que a ET-743 tem mostrado na clínica, o seu mecanismo de ação vem sendo amplamente investigado. Sabe-se que a ET-743 se liga na volta menor do DNA e influencia a dinâmica da hélice. Neste trabalho, o mecanismo de ação da ET-743 foi estudado em modelos eucarióticos de células da levedura Saccharomyces cerevisiae e em células de mamíferos, incluindo linhagens tumorais humanas. A utilização do modelo de levedura revelou que o sistema de reparação por excisão de bases está envolvido com o mecanismo de citotoxicidade da ET-743. Além disso, o emprego de mutantes de levedura permitiram explicar como ocorre a tolerância e a reparação dos danos gerados pela ET-743 nas linhagens que são resistentes à ação da droga. Além do mecanismo molecular proposto, este trabalho proporcionou uma possível explicação para a especificidade da ET-743 em tumores do tipo sarcomas. Considerando que a resistência dos sarcomas à maioria das drogas clássicas seja devido a superexpressão de APE1, entre outros fatores...

Sintese de aminoesteres a partir de adutos de Baylis-Hillman : precursores de aminoacidos não proteinogenicos

Ricardo Silva Porto
Fonte: Biblioteca Digital da Unicamp Publicador: Biblioteca Digital da Unicamp
Tipo: Dissertação de Mestrado Formato: application/pdf
Publicado em 01/06/2003 PT
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46.18%
Proteínas e peptídeos constituem unidades estruturais de elevada importância para a manutenção de vários processos biológicos vitais. O uso de aminoácidos estruturalmente modificados, ditos não proteinogênicos, na compreensão de vários processos biológicos é uma estratégia de grande valia na pesquisa químico-biológica. O grande interesse biológico desses aminoácidos não proteinogênicos associado ao nosso interesse em explorar os adutos de Baylis-Hillman como substratos para a sua preparação nos levou a desenvolver esse trabalho que têm por objetivo preparar a- e b-aminoácidos com centros quaternários em posição a- (figura). No nosso entender, aminoésteres como mostrado acima podem ser obtidos a partir da abertura de anéis de epóxidos e aziridinas com nucleófilos convenientes. Estes epóxidos e aziridinas por sua vez podem ser preparados a partir do aduto de Baylis-Hillman resultante da reação entre uma olefina elétron-deficiente (a,b-insaturada) e um aldeído sob a influência de um catalisador, geralmente uma amina terciária (esquema). Neste trabalho, descrevemos os resultados referentes a preparação de aminoésteres a partir de adutos de Baylis-Hillman, através das duas estratégias propostas. Na primeira rota...

Papel de fosfatases na viabilidade de celulas da leucemia mieloide humana tratadas com diterpeno lactona

Ana Claudia Galvão Freire
Fonte: Biblioteca Digital da Unicamp Publicador: Biblioteca Digital da Unicamp
Tipo: Tese de Doutorado Formato: application/pdf
Publicado em 06/12/2002 PT
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36.12%
A linhagem celular da leucemia promielocítica humana (HL60) foi estabelecida a partir do sangue periférico de uma paciente com leucemia promielocítica aguda. Essa cultura prolifera continuamente em suspensão, consiste predominantemente de promielócitos e tem sido utilizada como alvo para o estudo do efeito citotóxico de drogas, diferenciação e morte celular. Neste trabalho foi avaliada a citotoxicidade de inibidores de proteínas fosfatases (ácido okadáico e pervanadato) e da desidrocrotonina (t-DCTN) através dos seguintes parâmetros de viabilidade, após 24h de tratamento: redução do MTT (integridade mitocondrial), dosagem do teor de proteínas (indicação do número de células) e atividade fosfatásica (metabolismo celular). Os dois inibidores de proteínas fosfatases apresentaram efeito citotóxico sobre as células HL60. Em relação à função mitocondrial e atividade fosfatásica, as células apresentaram somente 20% de viabilidade em presença do ácido okadáico (100 nM) e pervanadato (200 11M). Para a t-DCTN foram obtidos os seguintes valores de ICso: 500 e 300 11M para o teor de proteína e redução do MTT, respectivamente. Outro aspecto abordado foi a relação entre o estado redox celular com uma possível indução da diferenciação e morte celular. Para este propósito foram determinados: redução do NBT...

Relação entre o efeito citotoxico de biocompostos sobre linfocitos T e atividade de fosfatases

Telma Maria Araujo Silva
Fonte: Biblioteca Digital da Unicamp Publicador: Biblioteca Digital da Unicamp
Tipo: Tese de Doutorado Formato: application/pdf
Publicado em 20/01/2003 PT
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35.89%
O objetivo deste trabalho foi relacionar o efeito citotóxico do ácido okadáico um potente e específico inibidor de serinaJtreonina fosfatase (PP1 e PP2A) e trans-desidrocrotonína, um 19-nor-clerodane, é o maior norditerpeno obtido da croton Cajucara; uma planta medicinal brasileira, a qual apresenta importante atividade bíologica como antineoplásica e antiulcerigênica sobre a cultura primária de linfócitos humanos com a atividade de fosfatases. Primeiramente, a fosfatase total foi caracterizada cineticamente através dos seguintes estudos: efeitos de substrato, pH, potenciais inibidores, metais e outros compostos. Nossos resultados mostraram que a fosfatase predominante nos linfócitos trata-se de uma proteína tirosina fosfatase, uma vez que hidrolisou eficientemente tirosina fosfato (60%), foi fortemente inibida pelo pervanadato (100%), vanadato (80%), p-cloromercuribenzoato (90%), coquetel inibidor de proteína tirosina fosfatase (70%) e apresentou insensibilidade ao ácido okadáico (100 nM). Nos estudos de citotoxicidade avaliamos o efeito do ácido okadáico e da desidrocrotonina, através dos seguintes parâmetros: redução do MTT (integridade mitocondrial), conteúdo total de proteínas (número de células) e atividade fosfatásica (metabolismo celular). Nos testes de citotoxicidade o ácido okadáico e a desidrocrotonina (na ausência do mitogêno) apresentaram efeito tóxico sobre linfócitos humanos quando analisados os parâmetros fosfatase e MTT com valores de ICso 47 e 100nM para o ácido okadáico; 450 fJM para a desidrocrotonina. O efeito mitogênico do OKA (10nM) sobre os linfócitos foi detectado 10 min após o tratamento com este composto...

Avaliação da expressão de genes de resistência às múltiplas drogas (MDRs) e de metabolização em diferentes linhagens celulares tratadas com complexos metálicos de rutênio; Expression of multiple drug resistance gene (MDR) on different cell lines treated with ruthenium (III) complexes

Costa, Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova
Fonte: Universidade Federal de Goiás; Brasil; UFG; Programa de Pós-graduação em Biologia (ICB); Instituto de Ciências Biológicas - ICB (RG) Publicador: Universidade Federal de Goiás; Brasil; UFG; Programa de Pós-graduação em Biologia (ICB); Instituto de Ciências Biológicas - ICB (RG)
Tipo: Tese de Doutorado Formato: application/pdf
POR
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56.01%
Não consta resumo em outro idioma.; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES; Foi com a descoberta da atividade antimitótica da cisplatina por Rosenberg na década se 1960 e 70, em seu célebre estudo com bactérias Escherichia coli, que surgiu o interesse em sintetizar e entender as bases moleculares responsáveis pelo mecanismo de ação biológica dos compostos metálicos, visto que a própria cisplatina foi inicialmente sintetizada por Peyrone nos idos de 1840. Os primeiros estudos envolvendo o uso de complexos metálicos de rutênio como agentes antitumorais foram realizados por Tochter no final dos anos 1980 (Dale et al., 1992). Àquela época, foi inferido que todos os compostos de rutênio apresentavam como mecanismo de ação, a sua ligação com o DNA, formando adutos e desencadeando processos celulares de natureza deletéria que, por fim, levariam a morte celular. É interessante lembrar que esse é o mesmo mecanismo de ação dos compostos de platina mais aceitos nos dias atuais. Sadler e Dyson (2003) estudando compostos de rutênio que continham cloro em sua estrutura, como o cloreto de cis-(dicloro)tetraaminorutênio(III) [cis-[RuCl2(NH3)4]Cl], observaram que estes compostos apresentavam mecanismos de ação biológica muito parecidos com os apresentados pela cisplatina [Pt(NH3)2Cl2]...

Estudo das funções da proteína Kin3 de Saccharomyces cerevisiae na resposta a danos no DNA

Moura, Dinara Jaqueline
Fonte: Universidade Federal do Rio Grande do Sul Publicador: Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Tipo: Tese de Doutorado Formato: application/pdf
POR
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26.1%
A resposta de células eucarióticas após exposição a estresse genotóxico é a ativação de uma intrincada rede de sensores, transdutores e efetores envolvidos em vias de reparação de DNA e controle de ciclo celular. Para garantir a fidelidade dessas vias regulatórias, existem mecanismos celulares evolutivamente conservados, chamados pontos de checagem, que monitoram a estrutura dos cromossomos, coordenando reparação de DNA e progressão do ciclo celular, controlando a capacidade da célula em parar o ciclo celular como resposta a danos no DNA, concedendo tempo para que ocorra a reparação. Os processos de reparação de danos no DNA são bem estabelecidos, porém, a sinalização para ativação de parada de ciclo celular na resposta a estas lesões é menos conhecida. A proteína Kin3 é uma serina treonina cinase de Saccharomyces cerevisiae estruturalmente relacionada à NIMA, um regulador mitótico descrito inicialmente no fungo Aspergillus nidulans, o qual está envolvido na regulação da progressão da fase G2/M e na organização de alguns eventos mitóticos. Como a maioria dos reguladores de ciclo celular é conservada, neste trabalho avaliou-se a função de Kin3p na resposta a danos no DNA. Nossos resultados demonstram que a deleção do gene KIN3 induz sensibilidade a cisplatina...

Identificação e quantificação de adutos covalentes formados entre a valina Nterminal da hemoglobina e o fármaco nevirapina em doentes de HIV: Desenvolvimento e validação de um método analítico por espectrometria de massa de alta resolução

Pereira, Catarina Correia da Cruz
Fonte: Universidade Nova de Lisboa Publicador: Universidade Nova de Lisboa
Tipo: Dissertação de Mestrado
Publicado em /09/2015 POR
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76.43%
A nevirapina é o fármaco antirretroviral mais utilizado nos países em desenvolvimento para combater o vírus da imunodeficiência humana (HIV). Apesar dos seus efeitos benéficos, a nevirapina tem sido associada a casos de hipersensibilidade cutânea e hepatoxicidade graves ou mesmo fatais. Estudos recentes sugerem o envolvimento da bioactivação do seu metabolito de Fase I, 12-OHNevirapina, a espécies electrofílicas capazes de formar adutos covalentes com proteínas. A identificação dos adutos formados, por esta via de bioactivação, com a valina N-terminal da hemoglobina (Hb) isolada de doentes sob terapêutica com a nevirapina foi já efectuada. A técnica analítica utilizada envolveu a utilização do método de derivatização N-alquilo Edman que, por reacção com fenilisotiocianato (PITC), permite destacar o aduto formado com o resíduo N-terminal da Hb, sob a forma de uma hidantoina, que foi posteriormente analisado e quantificado por cromatografia líquida acoplado à espectrometria de massa de tandem por ionização de electrospray. O presente trabalho teve como objectivo inicial optimizar o procedimento experimental envolvido no procedimento de N-alquilo Edman, tendo-se inicialmente comparado a sensibilidades obtidas mediante a utilização de dois agentes derivatizante: o PITC e o isotiocianato de fluoresceína (FTIC). Este processo inicial permitiu estabelecer que a utilização do PTIC como agente de derivatização conduzia a melhores resultados...